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申请/专利权人：中国科学院基础医学与肿瘤研究所(筹)

摘要：本发明提出了一种肿瘤新抗原肽的筛选方法及新抗原疫苗抗癌应用方法，本发明拟通过虚拟筛选手段结合常用预测方法，发现高HLA‑A*24:02结合力的抗原锚定残基的特征参数；进一步基于晚期免疫治疗耐药的结直肠癌患者的基因分析，结合本发明中的特征参数及已报道的结直肠癌高频突变基因、HLA分型、TB细胞抗原表位预测等参数，筛选得到高HLA‑A*24:02结合力的限制性肿瘤新抗原，联合甘露寡糖作为佐剂，组成新抗原疫苗，显著增强DC和CTL免疫细胞的抗肿瘤作用。本发明经体外特异性CTL细胞活化试验验证新抗原疫苗杀灭肿瘤细胞的有效性，并采用转录组测序以发现相关作用机制，该机制有望成为克服晚期结直肠癌免疫耐药的关键途径。

主权项：1.一种肿瘤新抗原肽的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、将来源于HPVE6、E7蛋白的具有HLA-A*24:02亲和力的多肽CYSLYGTTL和HYNIVTFCC的锚点残基第2位和第9位分别行位点扫描，并保存为pdb格式；后加载至Autodock软件，添加原子电荷，分配原子类型，所有柔性键均默认可旋转，保存为pdbqt格式，作为对接配体；S2、使用pymol删除HLA-A*2402晶体结构PDBID：7JYV中的结晶水和其他小分子，加氢，转换为pdb格式；后载入Autodock软件，添加原子电荷，分配原子类型，保存为pdbqt格式，作为对接受体；S3、采用AutodockVina1.1.2对多肽与HLA进行分子对接，exhaustiveness参数设置为32，其他参数默认；设置对接盒子，完全包裹HLA结合凹槽；选择打分最高的构象，作为对接构象，后续进行分子动力学模拟；S4、采用Amber18软件包，设置参数如下：多肽和HLA分子均使用ff14SB力场参数；载入tleap模块；自动加氢和拮抗离子Na+以中和电荷；选择TIP3P显性水模型，设置周期性边界条件，水盒子边界离分子最近距离不低于1nm；S5、步骤S4中，首先通过约束蛋白和多肽的重原子，将水分子进行10000步含5000步最速下降法和5000步共轭梯度法能量最小化；随后，放开约束，将整个体系进行10000步能量最小化含5000步最速下降法和5000步共轭梯度法；能量最小化结束后，在50ps时间内，将体系缓慢加热至300K；加热完成后，在NPT系综下保证体系的原子数量N、压强P和温度T保持不变对体系进行50ps的平衡；最后将体系在NPT系综下进行50ns的分子动力学模拟，时间步长2fs；每隔10ps保存一次轨迹数据，并用CPPTRAJ模块进行相关分析；配体和蛋白的结合自由能计算则采用MMPBSA.py模块进行，以HLA作为受体R，多肽作为配体L进行计算；S6、对步骤S5中得到的数据进行数据收集；S7、分别对锚定残基行位点扫描后的抗原与HLA间的亲和力和稳定性进行预测；S8、步骤S7中预测的结果采用SPSS软件进行统计学分析；若指标数据符合正态性检验和方差齐性检验，则使用方差分析；否则使用非参数检验；使用Pearson相关系数表示相关关系的强弱情况，当p值＜0.05时被认为差异具有统计学意义。

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