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申请/专利权人：昆明理工大学

摘要：本发明公开了基于胚胎分割技术建立非人灵长类自体胚胎干细胞的方法，涉及干细胞生物学及再生医学技术领域，包括分别取非人灵长类动物卵子供体和精子供体的卵子和精子经体外受精后获得卵裂期胚胎，将卵裂期胚胎分割为两个分割胚胎；将两个分割胚胎中的一个用于建立胚胎干细胞，另一个用于移植至代孕受体后获得新生动物个体；分别提取卵子供体、精子供体、代孕受体、新生动物个体及ESCs的DNA并分析微卫星亲缘关系，当ESCs和新生动物个体的短串联重复序列位点完全一致，则成功建立了非人灵长类自体胚胎干细胞。本发明将一个胚胎分割为两个分割胚胎，既建立了ESCs又获得个体，为建立自体多能干细胞提供新的选择，并为建立人自体胚胎干细胞提供参考。

主权项：1.基于胚胎分割技术建立非人灵长类自体胚胎干细胞的方法，其特征在于，包括：分别取非人灵长类动物卵子供体的卵子和精子供体的精子经体外受精后获得卵裂期胚胎，将卵裂期胚胎分割为两个分割胚胎；将所述两个分割胚胎中的一个胚胎用于建立胚胎干细胞，将另一个胚胎用于移植至代孕受体后获得新生动物个体；分别提取卵子供体、精子供体、代孕受体、新生动物个体及胚胎干细胞的DNA并分析微卫星亲缘关系，当胚胎干细胞和新生动物个体检测的17个短串联重复序列（shorttandemrepeat,STR）位点完全一致，则成功建立了非人灵长类自体胚胎干细胞及获得了新生动物个体；所述卵裂期胚胎为八细胞期胚胎；当卵裂期胚胎为八细胞期胚胎时，将所述八细胞期胚胎按照3:5比例分割成两个分割胚胎；将分割胚胎进行体外培养，将培养5-6天的58分割胚胎移植至代孕受体后获得新生动物个体；将培养7-8天的38分割胚胎用于建立胚胎干细胞；准备用于松弛细胞骨架增强卵裂球韧性的微滴：取35mm低吸附培养皿，用含有5µgml细胞松弛素B的胚胎操作缓冲液TH3做6个30µl的滴，用胚胎操作缓冲液TH3做6个30µl的滴，加入3.5ml石蜡油置于热台上预热至37℃即可；准备胚胎显微操作微滴：取35mm培养皿皿盖，用含有5µgml细胞松弛素B的胚胎操作缓冲液TH3做60µl的滴，加入3.5ml石蜡油置于热台上预热至37℃即可；将分割胚胎进行体外培养时，对于八细胞期前的胚胎，培养在HECM-9加入10%的Vitrolife的G1培养基中；对于八细胞期及之后阶段的胚胎，培养在HECM-9加入10%的Vitrolife的G2培养基中；所述非人灵长类动物为猴。

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