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申请/专利权人：云南省农业科学院甘蔗研究所

摘要：本发明公开了一种快速检测甘蔗梢腐病三种致病菌的方法，包括以下步骤：基因组DNA的提取；提供引物对：选取甘蔗梢腐病轮枝镰刀菌、层出镰刀菌和甘蔗镰刀菌三种致病菌中一种或多种检测引物的上游引物和下游引物；提供检测试剂：检测试剂包括2×EasyTaqPCRSuperMix和灭菌去离子水；置入PCR反应体系中进行PCR反应；结果判定：对所述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳结果进行判定。本发明可在一次PCR扩增反应内同时检测甘蔗梢腐病轮枝镰刀菌、层出镰刀菌以及甘蔗镰刀菌三种致病菌；本发明建立的多重PCR检测方法可用于轮枝镰刀菌、层出镰刀菌以及甘蔗镰刀菌病原菌检测，也能对田间感染轮枝镰刀菌、层出镰刀菌以及甘蔗镰刀菌甘蔗病样进行检测。

主权项：1.一种快速检测甘蔗梢腐病三种致病菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、基因组DNA的提取：采用真菌基因组DNA提取试剂盒按说明书提取轮枝镰刀菌、层出镰刀菌和甘蔗镰刀菌菌株基因组DNA为检测样本；以健康甘蔗叶片基因组DNA为阴性对照，以无菌ddH2O为空白对照，后置于-20℃冰箱保存；S2、提供引物对：选取甘蔗梢腐病轮枝镰刀菌、层出镰刀菌和甘蔗镰刀菌三种致病菌中一种或多种检测引物的上游引物和下游引物；S3、提供检测试剂：检测试剂包括2×EasyTaqPCRSuperMix和灭菌去离子水；S4、置入PCR反应体系中进行PCR反应：S4.1、原料准备：取5～15μL的2×EasyTaqPCRSuperMix，取0.75～2.25μL的上游引物，取0.75～2.25μL的下游引物，取1～3μL的基因组DNA，取2.5～7.5μL的灭菌去离子水；S4.2、反应过程：将上述原料混合，在92～96℃下预变性2～4min、在92～96℃下变性25～35秒、在56～60℃下退火25～35秒、在70～74℃下延伸1～2min、进行34～36个循环，最后在72℃下再延伸4～6min。S5、结果判定：对所述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳结果中轮枝镰刀菌扩增的目的条带、层出镰刀菌扩增的目的条带、甘蔗镰刀菌扩增的目的条带，阴性对照扩增的目的条带和空白对照扩增的目的条带，判断待测样品；当待测样品电泳结果中含有三种致病菌对应的条带，则判定待测样品中含有对应的病原菌。

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