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申请/专利权人：复旦大学附属肿瘤医院

摘要：本发明公开了一种脑转移相关候选基因的CRISPRCas9文库高通量筛选方法，该方法包括构建脑转移相关基因的sgRNA文库，将sgRNA文库进行慢病毒包装，感染稳定表达CAS9蛋白的宿主细胞，并筛选以获得稳定表达sgRNA文库的细胞，然后，将慢病毒感染后的细胞接种于免疫缺陷的小鼠颅内及脂肪垫，最后，将颅内成瘤及皮下成瘤的肿瘤组织取出，提取基因组DNA后，对sgRNA的靶向区进行二代测序建库，通过筛选前后sgRNA的丰度变化，进而找出脑转移相关候选基因。该方法建立了脑转移相关基因高通量筛选技术，能够准确、高效地挖掘调控脑转移的关键基因，为脑转移预防和治疗提供新靶点、新途径。

主权项：1.一种三阴性乳腺癌脑转移相关候选基因的CRISPRCas9文库高通量筛选方法，其特征在于，包括以下步骤，步骤S1、构建脑转移相关基因的sgRNA文库，具体为a提供核酸构建物Z1，所述的核酸构建物Z1具有以下结构：L-N20-R其中，L为位于脑转移相关基因的sgRNA的编码序列上游的左同源臂序列，N20为脑转移相关基因的sgRNA编码序列，R为位于脑转移相关基因的sgRNA的编码序列下游的右同源臂序列；b以所述的核酸构建物Z1为模板，进行PCR扩增，从而获得扩增产物；c将所述扩增产物与经线性化的表达载体混合，并用Gibsonassembly法进行连接，从而形成连接产物；d将所述连接产物转化大肠杆菌，从而获得转化子，并从所述转化子中抽提质粒，从而获得所述的脑转移相关基因的sgRNA文库步骤S2、将sgRNA文库进行慢病毒包装，感染稳定表达CAS9蛋白的宿主细胞，并筛选以获得稳定表达sgRNA文库的细胞；步骤S3、将慢病毒感染后的细胞接种于免疫缺陷的小鼠颅内及脂肪垫；步骤S4、将颅内成瘤及皮下成瘤的肿瘤组织取出，提取基因组DNA后，对sgRNA的靶向区进行二代测序建库，通过比较前后sgRNA的丰度变化，筛选出三阴性乳腺癌脑转移相关候选基因；其中，所述三阴性乳腺癌脑转移相关基因为在脑转移灶与肿瘤原发灶中差异表达的基因：AAGAB、ANK1、C15orf48、CCT5、CLIC3、CRABP2、DOHH、ERICH2、FOXRED2、GMPR、HLA-DRB1、IMPACT、LAMP5、MAP6D1、AARS、ANP32A、C1QBP、CCT7、CLPB、CRYM、DPH2、ESF1、FREM2、GNAO1、HMGB2、INA、LCN2、MAP7、ABCF1、AP1M2、C2orf47、CD180、CLPTM1、CSTB、DPP10、ETHE1、FSCN1、GNE、HMGCS1、IRGQ、LDHA、MAPK10、ABCF2、APOA2、C4BPA、CDA、CLTA、CTNNA2、DPP6、EXOSC5、FXYD3、GPM6A、HP、KARS、LDHB、MAPRE2、ABTB2、APRT、C4BPB、CDC20、CLU、CTNNAL1、DUS1L、FABP5、GABRB2、GPM6B、HPCAL4、KBTBD11、LGI1、MAPT、ACBD7、AQP4、CA2、CDH15、CNDP1、CYCS、E2F1、FABP7、GABRG2、GRHL1、HPRT1、KCND3、LGR6、MB、ACO2、AQP5、CA8、CDH18、CNKSR2、DAXX、ECE2、FADS2、GALK1、GRPEL1、HRAS、KCTD14、LPO、MBP、ACSL6、ARG2、CADM1、CDH3、CNP、DBI、ECH1、FAHD1、GAMT、GSK3A、HSBP1、KDELR3、LRRC16A、MCAT、ACTN2、ARHGDIA、CADM3、CDK1、CNTN1、DCTPP1、EEF1A2、FAM210A、GAN、GTF3C5、HSP90AA1、KIF20A、LRRC47、MCM2、ADD2、ARL6IP1、CADM4、CDK11B、COPS4、DCXR、EEF1E1、FAM213B、GAP43、H2AFZ、HSP90AB1、KIF21A、LTF、MCM6、AFG3L2、ASS1、CADPS、CDK5、COQ3、DDX39A、EIF3I、FAM64A、GCA、HAPLN2、HSPA4L、KIF23、LXN、MCM7、AIF1L、ATAD3A、CAMK2A、CHCHD2、CORO2B、DDX49、EIF3J、FASN、GCC1、HBA2、HSPA6、KIF5C、LYAR、MCTS1、AIMP2、ATP1A2、CAMK2B、CHGA、COX4I1、DHCR7、EIF4A3、FCGR3B、GDA、HDGF、HSPA8、KIT、LYN、MDH1、ALDH9A1、ATP1A3、CAND2、CHI3L1、COX5A、DIRAS1、EIF5B、FGA、GDE1、HDHD3、HSPA9、KLK5、MAG、MEPCE、ALDOA、ATP2B2、CANT1、CHI3L2、COX6A1、DLGAP1、EMC6、FGB、GDPD1、HEPACAM、HSPD1、KPNA2、MAGEA4、MEST、ALDOC、ATP5D、CBS、CHL1、COX6C、DNAH11、EMC8、FGF1、GFAP、HID1、HSPE1-MOB4、KREMEN2、MANF、METTL1、ALG1、ATP5I、CCDC134、CHP1、CPB2、DNAJA1、EPB41L4B、FGG、GGH、HIP1R、IDH3B、KRT13、MAOB、MIA、ALG3、ATP6V1G2、CCDC137、CITED4、CPLX2、DNAJB1、EPB41L5、FKBP4、GINS2、HIST1H1A、IFRD2、KRT15、MAP1A、MKI67、ALPL、BID、CCDC47、CKB、CPS1、DNAJB11、EPCAM、FKBP8、GLDC、HIST1H1D、IGFBP2、KYNU、MAP1B、MLF2、ALYREF、BOLA3、CCDC51、CLGN、CRABP1、DNAJC6、EPHB4、FMN2、GLIPR2、HK2、IMPA2、LAMC3、MAP2、MMP12、MTIF2、NDUFAB1、NOL11、PBK、PLCB4、PRMT1、RAB6B、RRM2、SCN2B、SLC35B2、SPCS1、SYNGR2、TIMP1、TSEN34、MZB1、NDUFB10、NOP10、PC、PLCH1、PRMT5、RAC3、RRP7A、SDHB、SLC3A2、SPINT1、SYNM、TJP2、TSN、NAA20、NDUFB11、NPTX1、PCSK1N、PLG、PROM2、RALBP1、RRS1、SDR16C5、SLC4A11、SPINT2、SYNPR、TJP3、TSPAN13、NACC1、NDUFB3、NQO1、PCYT2、PLP1、PRPF4、RAN、RSL1D1、SEC23B、SLC4A4、SPTBN1、SYP、TK1、TTLL12、NAPG、NDUFB6、NR2C2AP、PDCL3、PLS1、PRSS8、RANGAP1、RTN1、SEC61B、SLC8A2、SRP68、SYT1、TMED1、TTYH1、NARS、NDUFB7、NRCAM、PDHX、PMP2、PSAT1、RARRES1、RTN2、SEH1L、SLC9A3R1、SSUH2、SYT11、TMEM159、TUBB2A、NAT10、NDUFB9、NRGN、PDIA4、PNMA5、PSMB5、REPIN1、RTN3、SELENBP1、SMARCD2、ST13、SYT12、TMEM256、TUBB2B、NCAM1、NDUFS5、NRM、PEG10、PNO1、PSMB6、RETN、RUVBL2、SH3GL2、SMARCD3、STIP1、SYT2、TMOD1、TUBB4A、NCAM2、NECAB2、NT5DC2、PES1、POLDIP3、PSMC5、RGS7、S100A6、SHANK1、SMDT1、STOML2、TACO1、TMX2、TUFM、NCAN、NEDD8、OPALIN、PEX5、POLE3、PSMD2、RHPN2、S100A8、SHMT2、SNAP25、STRA6、TAF9B、TNFRSF21、TXN、NCAPD2、NEDD8-MDP1、P4HB、PFKM、POLR1A、PTMA、RIMBP2、S100A9、SLC12A5、SNAP91、STUB1、TAGLN3、TNFRSF6B、TXN2、NCAPG、NEFH、PA2G4、PFN2、POLR2K、PTMS、RMI2、S100P、SLC14A1、SNCA、STX1B、TALDO1、TNR、TXNDC17、NCCRP1、NEFL、PACSIN1、PGAM5、PPFIA3、PTPN2、RNASE2、SAA1、SLC17A7、SNCB、STXBP1、TCEAL2、TOMM22、TXNRD1、NCDN、NEFM、PACSIN3、PHF5A、PPM1E、PTX3、RNASEH2A、SAA2、SLC1A2、SNRPB、SUMO2、TCN1、TOMM40、TYMS、NCL、NFU1、PADI2、PHYHIPL、PPP1CA、PUSL1、RPH3A、SAA2-SAA4、SLC1A3、SNRPB2、SUPT16H、TEX2、TOP2A、UBE2M、NDRG2、NGEF、PAFAH1B3、PI15、PPP1R1B、PYCR1、RPL36A-HNRNPH2、SAMD12、SLC25A10、SNRPC、SV2A、TFB2M、TPI1、UBE2O、NDRG4、NIP7、PAGE2、PIGR、PPP4C、QDPR、RPP25、SARS2、SLC25A22、SNRPD2、SYN1、TFRC、TPMT、UBE2T、NDUFA2、NIPSNAP1、PAICS、PKP3、PRC1、QPRT、RPRD1A、SBSN、SLC26A2、SOD2、SYN2、THOC6、TPPP、UCHL1、NDUFA6、NME1、PAIP1、PLA2G4A、PRDX2、RAB3A、RPS6、SCG2、SLC26A4、SOX10、SYN3、TIMM10、TRMT112、UGT8、NDUFA8、NME1-NME2、PARK7、PLAA、PRKAR2B、RAB3C、RPUSD2、SCIN、SLC34A2、SPC25、SYNGR1、TIMM9、TRMT6、UQCR10。

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