买专利卖专利找龙图腾，真高效！ 查专利查商标用IPTOP,全免费！专利年费监控用IP管家,真方便！

申请/专利权人：山东福洋生物科技股份有限公司

摘要：本发明公开了一种协同高表达GOD和CAT在黑曲霉高效产葡萄糖氧化酶的方法，属于生物工程技术领域。本发明公开的一种协同高表达GOD和CAT在黑曲霉高效产葡萄糖氧化酶的方法，首先构建含有BleoRG418抗性基因的重组质粒，然后将GOD、p2a和CAT基因引入，导入黑曲霉宿主菌株FG‑2，通过抗生素压力50‑1000ugml筛选法实现GOD的大量分泌，同时酶活得到大幅度提升。

主权项：1.一种协同高表达GOD和CAT在黑曲霉高效产葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于，具体步骤如下：1构建重组载体pAN7-1-BleoR和pAN7-1-G418①以BleoR基因片段为模板，利用引物BleoR-fr进行PCR扩增，获得目的基因片段BleoR；以G418基因片段为模板，利用引物G418-fr进行PCR扩增，获得目的基因片段G418；所述BleoR基因片段如SEQIDNO.9所示；所述G418基因片段如SEQIDNO.10所示；②以质粒pAN7-1为模板，利用引物BleoR-zai-fr进行PCR扩增，获得BleoR对应的载体骨架pAN7-1；利用G418-zai-fr进行PCR扩增，获得G418对应的载体骨架pAN7-1；③将步骤①获得的目的基因片段和步骤②获得的载体骨架分别对应利用快速内切酶DpnI消化后，进行一步克隆连接，获得重组载体pAN7-1-BleoR和pAN7-1-G418；2构建重组载体pAN7-1-BleoR-GOD-p2a-CAT和pAN7-1-G418-GOD-p2a-CAT①以黑曲霉FG-2提取的基因组为模板，利用引物GOD-fr对其进行PCR扩增，得到GOD基因片段；②分别以步骤1获得的重组载体pAN7-1-BleoR和pAN7-1-G418为模板，利用引物GOD-zai-fr进行PCR扩增，得到载体骨架pAN7-1-BleoR和pAN7-1-G418；③将步骤①获得的GOD基因片段分别与步骤②获得的线性化载体利用快速内切酶DpnI消化后，进行一步克隆连接，获得重组载体pAN7-1-BleoR-GOD和pAN7-1-G418-GOD；④分别以重组质粒pAN7-1-BleoR-GOD和pAN7-1-G418-GOD为模板，利用引物p2a-fr对其进行PCR扩增，获得线性化的重组载体pAN7-1-BleoR-GOD和pAN7-1-G418-GOD；⑤将步骤④获得的线性化的重组载体pAN7-1-BleoR-GOD和pAN7-1-G418-GOD分别利用快速内切酶DpnI进行消化，通过一步克隆的方法将线性化重组载体自连接，获得pAN7-1-BleoR-GOD-p2a和pAN7-1-G418-GOD-p2a；⑥以黑曲霉FG-2基因组为模板，利用引物CAT-fr对其进行PCR扩增，获得CAT基因片段；⑦分别以重组质粒pAN7-1-BleoR-GOD-p2a和pAN7-1-G418-GOD-p2a为模板，利用引物CAT-zai-fr进行PCR扩增，获得待连接CAT基因片段的重组载体pAN7-1-BleoR-GOD和pAN7-1-G418-GOD；⑧利用快速内切酶DpnI将回收的载体骨架和基因片段进行消化，通过一步克隆的方法将重组载体pAN7-1-BleoR-GOD和pAN7-1-G418-GOD分别与CAT基因片段进行连接，获得重组载体pAN7-1-BleoR-GOD-p2a-CAT和pAN7-1-G418-GOD-p2a-CAT；3以黑曲霉FG-2为出发菌株，表达重组载体pAN7-1-BleoR-GOD-p2a-CAT和pAN7-1-G418-GOD-p2a-CAT将重组质粒pAN7-1-BleoR-GOD-p2a-CAT和pAN7-1-G418-GOD-p2a-CAT分别转化进FG-2中，经抗生素压力筛选获得基因工程菌株FG-2-BleoR-GOD-CAT以及FG-2-G418-GOD-CAT。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 山东福洋生物科技股份有限公司 一种协同高表达GOD和CAT在黑曲霉高效产葡萄糖氧化酶的方法