申请/专利权人：中国科学院南京地理与湖泊研究所

申请日：2018-04-28

公开（公告）日：2018-10-16

公开（公告）号：CN108660190A

主分类号：C12Q1/6851(2018.01)I

分类号：C12Q1/6851(2018.01)I;C12Q1/04(2006.01)I;G06F19/18(2011.01)I;G06F17/18(2006.01)I;C12R1/89(2006.01)N

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.04.03#授权;2018.11.09#实质审查的生效;2018.10.16#公开

摘要：本发明提供了一种基于细胞分裂ftsZ基因表达量的蓝藻快速生长期判别方法，从湖泊原位取样，对样品进行RNA提取和反转录后，利用ftsZ和16SrRNA引物扩增经反转录得到的微囊藻cDNA；荧光定量PCR扩增每个样品的ftsZ和16SrRNA基因，以16SrRNA为管家基因，ftsZ为目的基因，推算单位细胞中ftsZ基因的相对表达量；利用湖泊原位分离的微囊藻，通过室内培养实验，建立微囊藻生长率μ和ftsZ基因相对表达量的回归方程，确定微囊藻的快速生长期，以此时ftsZ基因相对表达量作为蓝藻快速生长期窗口的阈值，大于该阈值判定为湖泊蓝藻快速生长期。本发明的方法可以实现快速的高通量检测，在数小时内获得多个样品的检测结果，能够准确判别蓝藻快的速生长期。

主权项：1.一种基于细胞分裂ftsZ基因表达量的蓝藻快速生长期判别方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）在春初至夏初，在湖泊不同采样点采集完整水柱的藻样，提取各样品RNA，并对RNA进行反转录得到微囊藻cDNA；（2）利用ftsZ基因和微囊藻16Sr RNA序列的引物扩增步骤（1）得到的微囊藻cDNA；（3）用荧光定量PCR扩增每个样品的ftsZ和16Sr RNA基因，以16Sr RNA为管家基因，ftsZ为目的基因，推算单位细胞中ftsZ基因的相对表达量；（4）利用采集的完整水柱的藻样分离出的微囊藻，通过室内培养实验，建立微囊藻生长率μ和ftsZ基因相对表达量的回归方程，确定微囊藻的快速生长期，得到此时ftsZ基因相对表达量，作为蓝藻快速生长期窗口的阈值，大于该阈值判定为湖泊蓝藻快速生长期。

全文数据：基于细胞分裂ftsZ基因表达量的蓝藻快速生长期判别方法技术领域[0001]本发明涉及一种基于细胞分裂ftsZ基因表达量的蓝藻快速生长期判别方法，属于水环境治理与蓝藻水华控制领域，涉及大型浅水湖泊、水库等富营养化治理与生态修复技术。背景技术[0002]我国湖泊富营养化问题日趋严重，蓝藻水华频发，已经严重影响到社会的发展和部分地区的饮水问题。湖泊蓝藻水华常以微囊藻Microcystis为优势种群。已有研究表明，水华形成过程分为4个阶段:下沉和越冬、复苏上浮、快速生长、水华聚集。可见在蓝藻水华形成聚集之前的快速生长期是蓝藻水华控制的关键阶段。目前湖泊蓝藻水华的控制方法主要是通过机械除藻等措施，但基本都是针对夏季蓝藻大量暴发时的应急措施，并不能有效削减和控制水华暴发。若能准确判别蓝藻快速生长时间段，并确定蓝藻复苏区域，开展针对性的有效抑制和削减措施，可以降低夏季水华发生频次和规模。[0003]自然水体中蓝藻的生长受温度、光强、营养盐等多种环境因素的影响，虽然目前太湖大部分湖区夏季都会出现水华蓝藻，但由于不同湖区在物理、化学、生物方面都存在着差异，并不是所有湖区都适宜蓝藻的生长。通过色素含量、细胞数等常规生物量参数的监测，只能获得蓝藻时空分布的一些表观信息，反映不出蓝藻在不同湖区会呈现出的生长状况和生长潜力。只有掌握蓝藻在不同湖区、不同时间的原位生长率，才能定量描述蓝藻在不同湖区的生长状态，以准确评估蓝藻在不同湖区的生长潜力，并据此对不同湖区制定出针对性的水体治理和水华控制策略。[0004]随着分子生物学技术的发展，从环境样品中提取RNA，运用实时荧光定量PCR技术，在转录水平上研究野外蓝藻基因的表达，确定阈值，可以快速、准确反映野外条件下蓝藻生长状态。专利文献CN104388544A公开了一种采用伪空胞基因（gvpC的表达量判别越冬蓝藻越冬复苏期界限的方法，为湖泊蓝藻控制发挥了一定作用，但是目前未见有关蓝藻快速生长期判别方法。专利文献CN102735671B公开了一种大型浅水湖泊越冬蓝藻种源疏浚位点的确定方法，通过底泥表层的色素含量表征蓝藻总生物量及其分布特征，确定清除越冬蓝藻种源的疏浚位点，为定向开展越冬蓝藻种源疏浚工程提供科学合理的依据。[0005]本发明可以实现快速的高通量检测，在数小时内获得多个样品的检测结果，能够准确判别蓝藻快的速生长期，为湖泊有效抑制快速生长的蓝藻提供了技术支撑。发明内容[0006]本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供了一种基于细胞分裂ftsZ基因表达量的蓝藻快速生长期判别方法，该方法采用在转录水平上的实时荧光定量PCR技术，能够快速准确的定量检测细胞分裂ftsZ基因表达，并通过建立微囊藻生长率μ和ftsZ基因相对表达量的回归方程，推断湖泊原位微囊藻生长率，从而判别出蓝藻快速生长期。[0007]为实现上述目的，结合附图说明，本发明具体采取以下方案：[0008]1在春初至夏初，在湖泊不同采样点采集完整水柱的藻样，提取各样品RNA，并对RNA进行反转录得到微囊藻cDNA;[0009]⑵利用ftsZ基因和微囊藻16SrRNA序列的引物扩增步骤⑴得到的微囊藻cDNA;[0010]3用荧光定量PCR扩增每个样品的ftsZ和16SrRNA基因，以16SrRNA为管家基因，ftsZ为目的基因，推算单位细胞中ftsZ基因的相对表达量；[0011]⑷利用采集的完整水柱的藻样分离出的微囊藻，通过室内培养实验，建立微囊藻生长率μ和ftsZ基因相对表达量的回归方程，确定微囊藻的快速生长期，得到此时ftsZ基因相对表达量，作为蓝藻快速生长期窗口的阈值，大于该阈值判定为湖泊蓝藻快速生长期。[0012]本发明的方法，所述步骤（1中，在湖泊不同采样点采集完整水柱的藻样，混合过滤，浓缩后快速转移至无RNase的冻存管中放入液氮保存。[0013]所述步骤⑵中，微囊藻CDNA扩增的PCR反应体系为：2mmolLdNTPmix5yL，25mmolLMg2+2yL，10ymolL上、下游引物各1.5yL，lUyL高保真DNA聚合酶lyL，10XPCRbuffer5yL，cDNA3yL，去离子水补足至50yL;[0014]其中ftsZ基因引物如下：[0015]ftsZF2GCTGAAGAATCGCGGGAAGA；ftsZR4ATCCAGCATCGGCCATGAT；[0016]微囊藻16SrRNA序列的引物序列如下：[0017]184FGCCGCRAGGTGAAAMCTAA;431RAATCCAAARACCTTCCTCCC。[0018]所述步骤4中，将分离取自湖泊的微囊藻群体分若干处理组在不同生长环境中培养，每天取样测量藻细胞的密度变化，获得藻细胞不同生长环境下各生长周期的生长率；生长率计算公式为:μ=InNt-InNot，其中，Nt和No分别代表t时刻和初始时刻的细胞密度;培养周期30天，每3天对各处理组的微囊藻进行取样，得到单位细胞中ftsZ基因的相对表达量。[0019]构建获得微囊藻生长率μ和ftsZ基因相对表达量的回归方程如下：[0020]Υ=〇·059+0·093Χ。[0021]根据回归方程确定微囊藻的快速生长期的的生长大于0.13CT1，得到此时ftsZ基因相对表达量为0.5，该值作为蓝藻快速生长期窗口的阈值，再利用该值推断湖泊原位微囊藻生长率，大于该阈值判定为湖泊蓝藻快速生长期。[0022]采用本发明的方法可以实现快速的高通量检测，在数小时内获得多个样品的检测结果，能够准确判别蓝藻快的速生长期，为湖泊有效抑制快速生长的蓝藻提供了技术支撑。附图说明[0023]图1是ftsz基因表达量与微囊藻生长速率的关系；[0024]图2是太湖不同月份蓝藻原位生长率。具体实施方式[0025]以下结合附图和实施例，以太湖为例，对本发明的技术方案作进一步详细描述。[0026]本发明的方法包括如下步骤：[0027]1在太湖不同采样点采集完整水柱的藻样，混合过滤，浓缩后快速转移至无RNase的冻存管中放入液氮中带回实验室，-70°C保存。采样时间为2017年3月到6月。并提取各样品RNA，对RNA进行反转录得到微囊藻cDNA。[0028]RNA提取的步骤:将低温保存的GFC滤膜，转移到裂解管BLysingMatrixB，玻璃珠直径0.1mm中，加入500yLBufferRLT，放置于FastPrep-24样品处理仪器中。设置FastPrep-24样品处理仪器参数，6ms，35s。击打破碎之后，立即取出裂解管并放入冰上，4°C，12000rpm条件下离心10s，紧接着将上清液转移至无RNase2mL离心管中。然后根据RNeasyPlantMiniKit试剂盒说明书操作。[0029]RNA反转录：反转录米用的是TransciptorFirstStrandcDNASynthesisKit反转录试剂盒，根据从不同样品中提取的RNA浓度，计算400ng所需体积。按照试剂盒进行反转录:加入lyLAnchored-oligodT和2yL随机六聚物引物，400ngRNA和适量PCR级别的水，使总体积为13yL，混合之后在PCR仪中65°C温浴IOmin。温浴之后再依次加入4yLtranscriptorreversetranscriptasereaction缓冲液、0.5yLRNA抑制剂、2yL脱氧核苷酸混合剂和〇.5yLtranscriptorreversetranscriptase，混勾之后放在PCR仪上反应，设置PCR仪的程序为25°：，1〇11^11、55°：，3〇1^11以及85°：，51^11。将反应完之后的？0?管立即放置冰上，将得到的cDNA保存在-20°C中备用。[0030]⑵利用ftsZ基因和微囊藻16SrRNA序列的引物扩增步骤⑴得到的微囊藻cDNA;[0031]对各样品进行RNA提取和反转录后，利用表1中的ftsZ和16SrRNA引物扩增经反转录得到的微囊藻CDNA13PCR反应体系为:2mmolLdNTPmix5yL，25mmolLMg2+2yL，上、下游引物（ΙΟμπιοΙL各1.5yL，高保真DNA聚合酶（TaKaRaJanpanlUyLlyL，10XPCRbuffer5yL，cDNA3yL，去离子水补足至50yL。[0032]表1扩增微囊藻ftsZ和16SrRNA基因的引物[0033][0034][0035]3用荧光定量PCR扩增每个样品的ftsZ和16SrRNA基因，以16SrRNA为管家基因，ftsZ为目的基因，推算单位细胞中ftsZ基因的相对表达量；[0036]4利用采集的完整水柱的藻样分离出的微囊藻，通过室内培养实验，建立微囊藻生长率μ和ftsZ基因相对表达量的回归方程，确定微囊藻的快速生长期，得到此时ftsZ基因相对表达量，作为蓝藻快速生长期窗口的阈值，大于该阈值判定为湖泊蓝藻快速生长期。[0037]分离取自太湖的微囊藻群体，以4.OXIO5CelVL为初始密度，将微囊藻分别培养在低温、低光、营养盐限制，以及适宜的生长环境中（表2，每处理组设置三个平行，每天取样用MUSE细胞计数器测量藻细胞的密度变化，获得藻细胞不同生长环境下各生长周期的生长率。生长率计算公式为:μ=InNt-InNotNt和No分别代表t时刻和初始时刻的细胞密度。[0038]培养周期30天，每3天对各处理组的微囊藻进行取样。根据上述方法得到单位细胞中ftsZ基因的相对表达量。[0039]最后对各样品的生长率μ和对应的ftsZ基因相对表达量进行线性回归，得到微囊藻生长率μ和ftsZ基因相对表达量的回归方程Y=O.059+0.093X如图1所示）。[0040]表2室内培养微囊藻的不同生长环境条件[0041][0042]根据微囊藻生长率μ和ftsZ基因相对表达量的回归方程，获得太湖不同湖区取样点的微囊藻原位生长率。[0043]根据太湖不同湖区微囊藻3月到5月原位生长速率的变化规律可以看出（图2，4月初，微囊藻的生长速率开始增加，一直持续到5月份，随后生长开始下降，因此认为微囊藻的快速生长期的生长大约为0.13CT1。该值作为蓝藻快速生长期窗口的阈值，判定蓝藻快速增长的窗口期为4月初一5月上旬。根据图1可以得到此时ftsZ基因相对表达量为0.5。该值作为蓝藻快速生长期窗口的阈值。[0044]采用本实施例的方法可以实现快速的高通量检测，在数小时内获得多个样品的检测结果，能够准确判别蓝藻快的速生长期，为湖泊有效抑制快速生长的蓝藻提供了技术支撑。

权利要求：1.一种基于细胞分裂ftsZ基因表达量的蓝藻快速生长期判别方法，其特征在于，包括如下步骤：1在春初至夏初，在湖泊不同采样点采集完整水柱的藻样，提取各样品RNA，并对RNA进行反转录得到微囊藻cDNA;2利用ftsZ基因和微囊藻16SrRNA序列的引物扩增步骤1得到的微囊藻cDNA;3用荧光定量PCR扩增每个样品的ftsZ和16SrRNA基因，以16SrRNA为管家基因，ftsZ为目的基因，推算单位细胞中ftsZ基因的相对表达量；4利用采集的完整水柱的藻样分离出的微囊藻，通过室内培养实验，建立微囊藻生长率μ和ftsZ基因相对表达量的回归方程，确定微囊藻的快速生长期，得到此时ftsZ基因相对表达量，作为蓝藻快速生长期窗口的阈值，大于该阈值判定为湖泊蓝藻快速生长期。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1中，在湖泊不同采样点采集完整水柱的藻样，混合过滤，浓缩后快速转移至无RNase的冻存管中放入液氮保存。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤⑵中，微囊藻cDNA扩增的PCR反应体系为：2mmolLdNTPmix5yL，25mmolLMg2+2yL，10ymolL上、下游引物各1.5μL，lUyL高保真DNA聚合酶lyL，10XPCRbuffer5yL，cDNA3yL，去离子水补足至50yL;其中：ftsZ基因引物如下：ftsZF2GCTGAAGAATCGCGGGAAGA；ftsZi?4ATCCAGCATCGGCCATGAT；微囊藻16SrRNA序列的引物序列如下：184FGCCGCRAGGTGAAAMCTAA;431RAATCCAAARACCTTCCTCCC。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4中，将分离取自湖泊的微囊藻群体分若干处理组在不同生长环境中培养，每天取样测量藻细胞的密度变化，获得藻细胞不同生长环境下各生长周期的生长率;生长率计算公式为:μ=InNt-InNot，其中，Nt和No分别代表t时刻和初始时刻的细胞密度;培养周期30天，每3天对各处理组的微囊藻进行取样，得到单位细胞中fisZ基因的相对表达量。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，构建获得微囊藻生长率μ和ftsZ基因相对表达量的回归方程如下：Y=O.059+0.093X〇6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，根据回归方程确定微囊藻的快速生长期的的生长大于0.13Cf1，得到此时ftsZ基因相对表达量为0.5，该值作为蓝藻快速生长期窗口的阈值，再利用该值推断湖泊原位微囊藻生长率，大于该阈值判定为湖泊蓝藻快速生长期。

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