申请/专利权人：徐州市中心医院

申请日：2017-02-14

公开（公告）日：2017-06-06

公开（公告）号：CN106801095A

主分类号：C12Q1/68(2006.01)I

分类号：C12Q1/68(2006.01)I;G01N33/68(2006.01)I

优先权：

专利状态码：失效-发明专利申请公布后的驳回

法律状态：2020.11.20#发明专利申请公布后的驳回;2017.06.30#实质审查的生效;2017.06.06#公开

摘要：本发明公开了PRRT1基因可以作为诊断冠心病的分子标志物。本发明研究证明与正常人相比，冠心病患者血液中PRRT1基因的mRNA表达水平显著下降。根据PRRT1基因与冠心病之间的存在的相关性，可以制备诊断冠心病的试剂盒，该试剂盒可以通过检测受试者血液中PRRT1基因的mRNA水平来判断是否发生冠心病，该试剂盒可在临床上广泛应用。

主权项：检测PRRT1基因表达的产品在制备诊断冠心病的工具中的应用。

全文数据：PRRT1基因在制备冠心病诊断产品中的应用技术领域[0001]本发明属于分子诊断领域，涉及一种用于冠心病诊断的分子标志物，具体涉及血液中的分子标志物-PRRH基因在制备诊断冠心病的产品中的应用。背景技术[0002]动脉粥样硬化性心脑血管病已成为世界范围关注的主要健康问题。2004年的世界卫生组织WHO报告显示，全世界每年心血管疾病以冠心病和脑卒中为主导致的死亡人数达高达1720万，占所有死亡人数的三分之一。预计2020年这一数字将进一步增加50%，高达2500万，心血管疾病是全球人类的“头号杀手”。在中国进行的一项大规模前瞻性研宄也显示，心脏疾病己经成为中国人群的主要死亡原因，分列男、女性死亡原因的第2位和第1位。我国每年新发心肌梗死50万人，随着生活方式的改变以及动脉粥样硬化相关的危险因素持续增加，冠心病与心肌梗死发病也还将呈持续上升趋势。[0003]大量的研究资料表明，冠心病是一种复杂疾病，是由多个微效基因与环境因素长期相互作用所致。因此鉴定出与冠心病相关的易感基因或致病基因，在人群中进一步筛选增加疾病风险的易感基因确定易感个体，将有助于冠心病的发病风险预测、新药开发、诊断和个体化治疗。发明内容[0004]为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于冠心病早期诊断的分子标志物。相比传统的冠心病的诊断方法，使用基因标志物来诊断冠心病具有及时性、特异性和灵敏性，从而使患者在疾病早期就能知晓疾病风险，针对风险高低，采取相应的预防和治疗措施。[0005]为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：[0006]本发明提供了检测PRRT1基因表达的产品在制备诊断冠心病的工具中的应用。[0007]进一步，上面所提到的检测PRRT1基因表达的产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测PRRT1基因表达水平以诊断冠心病的产品。[0008]进一步，所述用RT-PCR诊断冠心病的产品至少包括一对特异扩增PRRT1基因的引物;所述用实时定量PCR诊断冠心病的产品至少包括一对特异扩增prrt1基因的引物;所述用免疫检测诊断冠心病的产品包括:与PRRT1蛋白特异性结合的抗体;所述用原位杂交诊断冠心病的产品包括:与PRRT1基因的核酸序列杂交的探针;所述用芯片诊断冠心病的产品包括:蛋白芯片和基因芯片;其中，蛋白芯片包括与PRRT1蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与PRRT1基因的核酸序列杂交的探针。[0009]在本发明的具体实施方案中，所述用实时定量PCR诊断冠心病的产品至少包括一对特异扩增?抓了1基因的引物的序列如5£〇10购.3和5£〇10州.4所示。[0010]优选地，所述诊断工具包括芯片、试剂盒、试纸或高通量测序平台。其中，高通量测序平台是一种特殊的诊断工具，检测PRRT1基因表达的产品可以应用于该平台实现对PRRTl基因的表达情况的检测。随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知PRRT1基因的异常与冠心病相关也属于PRRT1基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。[0011]本发明还提供了一种诊断冠心病的工具，所述诊断工具包括芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台。[0012]其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片;所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测PRRT1基因转录水平的针对PRRT1基因的寡核苷酸探针;所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的PRRT1蛋白的特异性抗体;所述基因芯片可用于检测包括PRRT1基因在内的多个基因（例如，与冠心病相关的多个基因）的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括PRRT1蛋白在内的多个蛋白质例如与冠心病相关的多个蛋白质）的表达水平。通过将多个与冠心病的标志物同时检测，可大大提高冠心病诊断的准确率。[0013]其中，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒;所述基因检测试剂盒包括用于检测PRRT1基因转录水平的试剂;所述蛋白免疫检测试剂盒包括PRRT1蛋白的特异性抗体。进一步，所述试剂包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片方法检测PRRT1基因表达水平过程中所需的试剂。优选度，所述试剂包括针对PRRH基因的弓丨物和或探针。根据PRRT1基因的核苷酸序列信息容易设计出可以用于检测PRRT1基因表达水平的引物和探针。[0014]与PRRT1基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。[0015]所述高通量测序平台包括检测PRRT1基因表达水平的试剂。[0016]所述试纸包括试纸载体和固定在试纸载体上的寡核苷酸，所述寡核苷酸能够检测PRRT1基因的转录水平。[0017]进一步，所述PRRT1蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述PRRT1蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰（例如，，嵌合抗体、scFv、Fab、Fab，）2、Fv等。只要所述片段能够保留与PRRT1蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。[0018]在本发明的具体实施方案中，所述针对PRRT1基因的引物序列如下:正向引物序列如SEQIDN0.3所示，反向引物如SEQIDN0.4所示。[0019]用于诊断冠心病的PRRT1基因及其表达产物的来源包括但不限于血液、组织液、尿液、唾液、脊髓液等可以获得基因组DNA的体液。在本发明的具体实施方案中，用于诊断冠心病的PRRT1基因及其表达产物的来源是血液。[0020]在本发明的上下文中，“PRRT1基因”包括PRRT1基因以及PRRT1基因的任何功能等同物的多核苷酸。PRRT1基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中PRRT1基因NC_000006.12DNA序列具有70%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；[0021]优选地，PRRH基因的编码序列包括以下任一一种DNA分子：[0022]1序列表中SEQIDN0.1所示的DNA序列；[0023]2在严格条件下与1限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列；[0024]3与⑴或⑵限定的DNA序列具有70%、优选地，90%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。[0025]在本发明的具体实施方案中，所述PRRT1基因的编码序列是SEQIDNO.1所示的DNA序列。[0026]在本发明的上下文中，PRRT1基因表达产物包括PRRT1蛋白以及PRRT1蛋白的部分肽。所述PRRH蛋白的部分肽含有与冠心病相关的功能域。[0027]“PRRT1蛋白”包括PRRT1蛋白以及PRRT1蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括PRRT1蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与PRRT1的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。[0028]优选地，PRRT1蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质：[0029]1由序列表中SEQIDN0.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；[0030]2将SEQIDN0.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和或缺失和或添加且与SEQIDN0.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQIDN0.2所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-5〇个，较佳地1_3〇个，更佳地1-20个，最佳地1-10个。[0031]⑶与SEQIDN0.2所示的氨基酸序列具有至少80%同源性又称为序列同一性），更优选地，与SEQIDN0.2所示的氨基酸序列至少约90%至95%的同源性，常为96%、97%、98%、99%同源性的氨基酸序列构成的多肽。[0032]在本发明的具体实施方案中，所述PRRT1蛋白是具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列的蛋白质。[0033]通常，己知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。[0034]通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是PRRT1蛋白的融合蛋白。对于与PRRT1蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留PRRT1蛋白的生物学活性即可。[0035]本发明的PRRT1蛋白也包括对SEQIDN0.2所示的氨基酸序列的非保守修饰，只要经过修饰的蛋白质仍然能够保留PRRT1蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突变的氨基酸数目通常是10个或者更少，例如6个或者更少，例如3个或者更少。[0036]在本发明的上下文中，“诊断冠心病”既包括判断受试者是否已经患有冠心病、也包括判断受试者是否存在患有冠心病的风险。[0037]本发明的优点和有益效果：[0038]本发明首次发现了PRRT1基因表达与冠心病相关，通过检测受试者中PRRT1的表达，可以判断受试者是否患有冠心病、或者判断受试者是否存在患有冠心病的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。_9]本发明发现了一种新的分子标记物-PRRT1基因，相比传统的检测手段，基因诊断更及时、更特异、更灵敏，能够实现冠心病的早期诊断，从而降低冠心病的死亡率。附图说明[0040]图1显示利用QPCR检测PRRT1基因在冠心病患者和正常人中的表达差异；[0041]图2显示利用基因芯片检测PRRT1基因在冠心病患者和正常人中的表达差异。[0042]具体的实施方式[0043]下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPreSS，1989中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。[0044]实施例1筛选冠心病患者和正常人中差异表达的基因[0045]1、研究对象：[0046]收集冠心病患者5例，正常人7例。[0047]冠心病组的纳入标准：按照世界卫生组织制定的缺血性心脏病的诊断标准，选择经冠状动脉造影证实有一支或多支血管狭窄程度50%的冠心病患者。对照组的入选标准为：1在流行病学调查时筛选年龄、性别、民族均与CAD组相匹配，经过问卷调查、体格检查、心脏超声检查及心电图检查及相关实验室检查没有冠心病的临床表现及主要危险因素的体检者;2住院行健康体检并行冠状动脉造影检查排除冠心病并年龄、性别、民族与CAD组匹配者;符合以上任何一条者入选为对照组。两组在纳入研宄前签署知情同意书。[0048]剔除标准:CAD组-临床资料不全者及同时合并以下疾病之一者予以剔除。[0049]如:先天性心脏病者、主动脉夹层、多脏器功能衰竭、风湿性心脏病以及具有精神障碍不能配合者）。对照组:有精神障碍者或经多普勒检查证实有颈动脉斑块或狭窄者，予以剔除。[0050]2、血液中总RNA的提取[0051]1勾衆处理Homogenization[0052]直接取新鲜的血液（外周血），加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10分钟，10，OOOrpm离心1分钟。彻底吸弃上清，收集白细胞沉淀。每100-200ul血液收集的白细胞沉淀加入lmlTRIzol。[0053]2分层（PhaseSeparation[0054]a.样品加入TRIzol后，室温放置5min，使样品充分裂解。[0055]b.每lmlTRIzol加入200ul氯仿，剧烈振荡混匀后室温放置3-5min使其自然分相。[0056]⑶RNA沉淀（RNAPrecipitation[0057]a.4°C12，OOOrpm离心10-15min。样品会分成三层:黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，把水相通常可吸取550yl转移到新管中。[0058]b.在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，室温放置10-201^11。4°：12,000叩111离心lOmin，弃上清，RNA沉淀于管底。[0059]⑷RNA漂洗（RNAWash[0060]a.RNA沉淀中加入lml75%乙醇（用RNase-free水配制），温和振荡离心管，悬浮沉淀。每lmlTRIzol加入lml75%乙醇。[0061]b.4°C5，000-8,OOOrpm离心l-2min，弃上清;短暂快速离心，用移液器小心吸弃上清，室温放置1-2分钟晾干沉淀。[0062]5溶解RNARedissolvingtheRNA[0063]沉淀中加入5〇-100ylRNase-free水，轻弹管壁，以充分溶解RNA，-7〇°C保存。[0064]3、1?嫩样品的质量分析他11〇0仰？1000分光光度计）[0065]NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品，OD260OD280为1•8-2•2。[0066]4、基因芯片杂交及扫描[0067]总RNA经线性化扩增后，cy3-UTP标记，荧光标记后的cRNAs采用RNEASYMiniKit纯化，用Amhion的RNAFragmentationReagents对标记好的cRNAs进行片段化处理。采用美国Agilent公司的人全基因表达谱芯片4x44K基因），在芯片杂交炉中65°C杂交17h，然后洗脱、染色，最后用AgilentDNAMicroarrayScanner扫描仪扫描。[0068]5、芯片数据处理与分析[0069]杂交后的芯片经芯片扫描仪读取数据点后，将数据导入分析软件，对于两组比值的自然对数绝对值大于2.0或小于〇.5的基因作为差异表达基因。[0070]6、统计学处理[0071]采用SPSS13.0统计软件进行数据分析，组间差异比较采用单因素方差分析法，P0.05差异有显著性意义。[0072]7、结果[0073]芯片结果如图2所示，与正常人相比，冠心病患者血液中PRRT1基因的mRNA水平显著下降，差异具有统计学意义P0•05。[0074]实施例2QPCR实验验证冠心病患者和正常人中差异表达的基因[0075]1、研宄对象：[0076]筛选标准同实施例1，冠心病患者和正常人各50例。[0077]2、血液中总RNA的提取[0078]步骤同实施例1。[0079]3、逆转录[0080]用逆转录缓冲液对lug总RNA进行逆转录合成cDNA。采用25ul反应体系，每个样品取lug总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入以下组分：DEPC水，5X逆转录缓冲液，10mmolLdNTP，0.1mmollDTT，30wimollOligodT，200UulM-MLV，模板RNAD42°C孵育lh，72°C10min，短暂离心。[0081]4、QPCR[0082]采用25ul反应体系，每个样本设置3个平行管。配制以下反应体系：SYBRGreen聚合酶链式反应体系12.5ul，正向引物5uMlul，反向引物5uMlul，模板CDNA2.0ul，无酶水8.5以1;扩增?1^1'1基因的正向引物序列为5’-—：17^〇：71^1'^〇：-3’旣010购.3，反向引物序列为5’-GATGATGACTACGGTGAG-3’（SEQIDN0•4;扩增GAPDH基因的正向引物序列为5-AAAGGGTCATCATCTCTG-3’（SEQID吣.5，反向引物序列为5’-0〇^!^01^六了六：1'1'：1'：-3’（SEQIDNO.6，各项操作均于冰上进行。扩增程序为:95t：5min，（95ri〇S，6rC6〇S*45个循环。以SYBRGreen作为荧光标记物，在LightCycler荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，AACT法进行相对定量。[0083]5、统计学方法[0084]实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值土标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，不同组之间的差异采用t检验，认为当P0•05时具有统计学意义。[0085]6、结果[0086]结果如图1所示，与正常人相比，冠心病患者血液中PRRT1基因的mRNA水平显著降低，差异具有统计学意义P〇.05，结果同芯片检测。[0087]上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若千改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

权利要求：1.检测PRRT1基因表达的产品在制备诊断冠心病的工具中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括:通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测PRRT1基因表达水平以诊断冠心病的产品。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述用RT-PCR诊断冠心病的产品至少包括一对特异扩增PRRH基因的引物;所述用实时定量PCR诊断冠心病的产品至少包括一对特异扩增PRRT1基因的引物;所述用免疫检测诊断冠心病的产品包括:与PRRT1蛋白特异性结合的抗体;所述用原位杂交诊断冠心病的产品包括:与PRRT1基因的核酸序列杂交的探针;所述用芯片诊断冠心病的产品包括：蛋白芯片和基因芯片;其中，蛋白芯片包括与PRRT1蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与PRRT1基因的核酸序列杂交的探针。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述用实时定量PCR诊断冠心病的产品至少包括的一对特异扩增?1«^1基因的引物如3£〇10勵.3和8£〇10奶.4所示。5.—种用于诊断冠心病的工具，其特征在于，所述工具能够通过检测样本中PRRT1基因的表达来诊断冠心病。6.根据权利要求5所述的工具，其特征在于，所述工具包括芯片、试剂盒、试纸或高通量测序平台。7.根据权利要求6所述的工具，其特征在于，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片;所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测PRRT1基因转录水平的针对PRRT1基因的寡核苷酸探针;所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的PRRH蛋白的特异性抗体;所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒;所述基因检测试剂盒包括用于检测PRRT1基因转录水平的试剂;所述蛋白免疫检测试剂盒包括PRRT1蛋白的特异性抗体;所述试纸包括用于检测PRRT1基因转录水平的试剂;所述高通量测序平台包括用于检测PRRT1基因转录水平的试剂。8.根据权利要求7所述的工具，其特征在于，所述检测PRRT1基因转录水平的试剂包括针对PRRT1基因的引物和或探针。9.根据权利要求8所述的工具，其特特征在于，所述针对PRRT1基因的引物序列如下：正向引物序列如SEQIDN0.3所示，反向引物如SEQIDN0.4所示。10.根据权利要求5-9中任一项所述的工具，其特征在于，所述样本是血液。

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