申请/专利权人：南京农业大学

申请日：2017-12-29

公开（公告）日：2018-07-27

公开（公告）号：CN108330100A

主分类号：C12N5/10(2006.01)I

分类号：C12N5/10(2006.01)I;C12N15/867(2006.01)I;C12Q1/02(2006.01)I

优先权：

专利状态码：失效-发明专利申请公布后的驳回

法律状态：2022.07.01#发明专利申请公布后的驳回;2018.08.21#实质审查的生效;2018.07.27#公开

摘要：本发明公开了一种稳定共表达鸡源BCRP和P‑gp转运体的MDCK细胞模型及其构建方法与应用。该细胞模型的名称为MDCK‑chBCRPP‑gp；制备方法为分别构建含鸡BCRP和鸡P‑gp慢病毒的表达载体，然后分别转染293T细胞得到含鸡BCRP和鸡P‑gp的慢病毒，再依次感染MDCK细胞，依次经含1μgmL的嘌呤霉素和1200µgml新霉素培养液筛选后得到稳定表达鸡BCRP和鸡P‑gp转运体的MDCK细胞模型。本发明的细胞模型可用于鸡BCRP和鸡P‑gp对其共同底物转运规律的研究，在禽类药物开发上有很好的应用前景。

主权项：1.一种稳定共表达鸡源BCRP和P‑gp转运体的MDCK细胞模型，其特征在于，分别构建含鸡BCRP和鸡P‑gp的慢病毒表达载体，然后分别转染293T细胞得到含鸡BCRP和鸡P‑gp的慢病毒，再依次感染MDCK细胞，依次经含1μgmL 的嘌呤霉素和1200µgml新霉素培养液筛选后得到稳定表达鸡BCRP和鸡P‑gp转运体的MDCK细胞模型，即MDCK‑chBCRPP‑gp。

全文数据：一种稳定共表达鸡源BCRP和P-gp转运体的MDCK细胞模型及其构建方法与应用技术领域[0001]本发明属于细胞工程技术领域，涉及一种稳定共表达鸡源BCRP和P-gp转运体的MDCK细胞模型及其构建方法与应用。背景技术[0002]自从组合化学问世以来，候选化合物的合成速度大大加快，如何在新药开发早期阶段就对候选化合物进行体外药动学的高通量筛选，并结合体外筛选结果尽早作出综合评价，已成为目前创新药物研究的主导趋势。而药物在转运蛋白层面的相互作用已被认为是引起代谢性药物相互作用的重要原因之一，FDA最新指导原则指出所有药物必须进行药物转运蛋白的检测分析。[0003]腺苷三磷酸结合盒转运蛋白（ATP-bindingcassettetransporter,ABC转运蛋白）是一类具有多种功能的膜蛋白超家族，其主要功能是利用ATP水解产生的能量将与其结合的底物转出质膜。根据ABC转运蛋白保守区序列的同源性，可将其分为7个亚型ABCA〜ABCG，其中ABCBlP-gp和ABCG2BCRP是研究较多的两个成员，也是与药物外排密切相关的两个转运蛋白。P-gp和ABCG2共分布在具有分泌和排泄功能的组织中，比如小肠、肝脏、胎盘和血脑屏障上。P-gp和ABCG2可以单独或是同时有效地外排众多的外源物质，包括常用的兽药，这在维持机体稳态的同时也限制了众多口服药物的吸收。[0004]细胞模型方法所需的药物量少、实验方法简单、药物分析迅速、温度、pH和环境条件可控，能够快速获得药物透膜的转运机制，达到体外高通量筛选的目的。但是原代细胞来源困难，不易培养，因此采用建立转基因细胞系的方法就成为研究药物与转运蛋白之间相互作用的重要方法。IVIDCKMadin-Darbycaninekidney细胞系是以马丁达比犬肾上皮细胞为原型，演变得到的一种细胞间具有紧密连接，且自身内源性转运蛋白和代谢酶活性较低的细胞系。因MDCK细胞与小肠上皮细胞生理特性类似，而常用于体外药物吸收特性的研究，且MDCK细胞培养周期较短，可以更快速的用于抑制剂的筛选及底物的鉴定。因此将ABC转运蛋白导入MDCK细胞系中，可建立一个理想的细胞模型。[0005]但目前运用于药物开发中药动学筛选的转运蛋白高表达的细胞模型存在两个特点：一是转运蛋白集中在人源ABC家族上，二是大多为转运体单表达的细胞模型。而ABC家族蛋白存在一定的物种差异性，且一个氨基酸的变化就可能会引起底物和抑制剂的变化，因此有必要对不同物种进行专一的研究;而转运体单表达的细胞模型无法深入研究多个转运蛋白之间的相互作用。发明内容[0006]针对现有技术问题，本发明的目的在于提供一种稳定共表达鸡源BCRP和p-gp转运体的MDCK细胞模型及其构建方法与应用，该细胞模型可研究BCRP和P-gp共同底物在不同的浓度下与BCRP和P-gp的亲和力，更准确预测所研究的分子化合物在体内的代谢情况。[0007]为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案为：[0008]一种稳定共表达鸡源BCRP和p-gp转运体的MDCK细胞模型，分别构建含鸡BCRP和鸡P-gp的慢病毒表达载体，然后分别转染293T细胞得到含鸡BCRP和鸡P-gp的慢病毒，再依次感染MDCK细胞，依次经含lygmL的嘌呤霉素和1200ygml新霉素培养液筛选后得到稳定表达鸡BCRP和鸡P-gp转运体的MDCK细胞模型，即MDCK-chBCRPP-gp。[0009]上述稳定共表达鸡源BCRP和p-gp转运体的MDCK细胞模型的构建方法，包括以下步骤：[0010]步骤1，构建含鸡BCRP的慢病毒表达载体[0011]从鸡新鲜的肠道组织提取总RNA，经反转录PCR获得cDNA序列;通过设计含有EcoRI和BamHI两个酶切位点的特异性引物以上述cDNA为模板特异性扩增得到目的基因；通过EcoRI和BamHI两个酶切位点双酶切慢病毒表达载体Lenti-III-RFP-C以得到线性化的载体;将目的基因与线性化慢病毒表达载体通过EcoRI和BamHI两个酶切位点连接后转入大肠杆菌DH5a中，得到含鸡BCRP的慢病毒表达载体Lenti-III-RFP-C-BCRP;[0012]步骤2,构建含鸡P-gp的慢病毒表达载体[0013]从鸡新鲜的肠道组织提取总RNA，经反转录PCR获得cDNA序列；通过设计第一轮特异性引物以上述cDNA为模板特异性扩增得到目的基因；设计第二轮特异性引物，以目的基因为模板对PCR产物进行5’端加attBl位点，3’端加attB2位点；按照Tranzymecloning试剂盒说明书（abmCatNO.E046进行BP反应将目的基因重组入入门载体pORF上；按照Fuzymecloning试剂盒说明书abmCatNo.E044进行LR反应将目的基因从入门载体pORF上重组到目的载体pLenti-III-CMV-GFP-2A-NE0上，从而得到含鸡P-gp的慢病毒表达载体pLenti-III-CMV-GFP-2A-NE0-P-gp；[0014]步骤3,含鸡BCRP的慢病毒表达载体和含鸡P-gp的慢病毒表达载体分别转染293T细胞[0015]将含鸡BCRP的慢病毒表达载体Lenti-III-RFP-C-BCRP和含鸡p-gp的慢病毒表达载体pLenti-III-CMV-GFP-2A-NE0-P-gp分别与包装质粒pLenti-P2A、pLenti-P2B组成三质粒慢病毒包装系统转染293T细胞，于37°C、5%⑶2细胞培养箱中培养8-14h后，换成完全培养液继续培养，转染48h后收集培养液，过滤离心后分别得到浓缩的含鸡BCRP的慢病毒和含鸡P-gp的慢病毒，并于-80°C冰箱中保存备用；[0016]步骤4，含鸡BCRP的慢病毒感染MDCK细胞[0017]培养MDCK细胞至融合度50%-60%，加入步骤3所得的含鸡BCRP的慢病毒，感染72h后，胰酶消化细胞重新接种于24孔板中培养至融合度40%，然后在培养基中加入1.0μgml的嘌呤霉素进行抗性筛选，持续筛选2周后，收集感染细胞，备用；[0018]步骤5，含鸡p-gp的慢病毒感染MDCK细胞[0019]培养步骤4所得的MDCK细胞至融合度50%-60%，加入步骤3所得的含鸡P-gp的慢病毒，感染72h后，胰酶消化细胞重新接种于24孔板中培养至融合度40%，然后在培养基中加入1200ygml新霉素进行抗性筛选，持续筛选2周后，收集感染细胞，备用；[0020]步骤6,单克隆筛选[0021]将步骤5所得的感染细胞稀释至密度为lOOOcellml的单细胞悬液，并接种于96孔板的第一列，〇.2ml孔，从第一列吸取0.ImL单细胞悬液接种于第二列并加入0.ImL培养液混合，从第二列中吸取0.ImL接种于第三列并加入0.ImL培养液混合，一直到最后一列，再将最后一列的细胞放于显微镜下观察，挑选出只有单个细胞的孔并做好标记，待单个细胞长成细胞团后，挑选出生长较好的单克隆细胞团，移到24孔板作扩大培养，分别取样裂解细胞，并逐个进行RT-qPCR检测，挑选出过表达效果最好的一孔，再将其扩大培养成稳定细胞模型；[0022]步骤7,验证[0023]对步骤6的细胞模型通过WesternBlot和焚光检测的方法进行蛋白表达的验证，通过对BCRP经典底物米托蒽醌和P-gp经典底物盐酸阿霉素的敏感性及对米托蒽醌和Rh〇123蓄积能力进行蛋白功能的确证。[0024]优选地，步骤1中特异性引物为：[0025]BCRP-FP:GAGAATTCGCCACCATGGGAACTGCTCAAAACAACAG；[0026]BCRP-RP:CAGGATCCTGTGAACTTCCTCATAAACCGGAG。[0027]优选地，步骤2中第一轮特异性引物为[0028]P-gp-FPl:GCCACCATGCATTCTGAAGATGAAAAGC；[0029]P-gp-RPl：CATGTTGCATGACCCACTTTGAAC；[0030]第二轮特异性引物为[0031]P-gp-FP2:[0032]GGGGACAACTTTGTACAAAAAAGTTGGCGCCACCATGCATTCTGAAGATGAAAAGC[0033]P-gp-RP2:GGGGACAACTTTGTACAAGAAAGTTGGGCATCAAGCGTAGTCTGGGACG[0034]优选地，步骤3含鸡BCRP的慢病毒表达载体和含鸡P-gp的慢病毒表达载体分别转染293T，包括以下步骤：[0035]第一步，将1.3-1.5XIO6的293T细胞接种到10厘米细胞培养板中，37°C、5%CO2条件下培养，待细胞达到70-80%融合度时进行转染备用；[0036]第二步，取两个1.5mL离心管，其中一个离心管加入ImL无血清培养基、IOyg慢病毒表达载体Lenti-III-RFP-C-BCRP、IOyg的慢病毒包装质粒pLenti-P2A和pLenti-P2B，混匀，室温孵育5min;另一个离心管中将80yL的Lentifectin转染试剂稀释到ImL无血清培养基中，混匀，室温孵育5min;两管混匀，室温孵育20min后再加入4.5mL的无血清培养基，即得到混匀的DNA-LentiFectin复合物；将准备好的包装细胞293T中的培养基吸掉，加入DNA-LentiFectin复合物，轻柔涡旋平板使复合物分散，37°C、5%CO2条件下培养8-14h后，加入新鲜完全培养液更换旧培养液;转染48h后收集培养基，用0.45μπι滤膜过滤该培养基得到纯化的病毒液，离心收集病毒颗粒，获得浓缩的含鸡BCRP的慢病毒，并于-80°C冰箱保存备用；[0037]第三步，将第二步操作中的IOyg慢病毒表达载体Lenti-III-RFP-C-BCRP换成慢病毒表达载体pLenti-III-CMV-GFP-2A-NE0-P-gp，含鸡P-gp的慢病毒表达载体转染293T细，重复第二步，获得浓缩的含鸡P-gp的慢病毒，并于-80°C冰箱保存备用。[0038]上述一种稳定共表达鸡源BCRP和P-gp转运体的MDCK细胞模型在鸡BCRP和鸡P-gp共同底物的研究上的应用。[0039]优选地，上述应用包括以下步骤:在P-gp和BCRP共同底物的双向转运试验中分别加入P-gp和BCRP的特异性抑制剂，从而通过抑制一种蛋白的外排来观察另一种蛋白的外排活动，计算被测药物在MDCK和MDCK-chBCRPP-gp细胞上的表观渗透系数和外排率，以及药物的净外排率，通过不同抑制剂添加条件下得净外排率的大小来预测BCRP和P-gp对共同底物的转运规律。[0040]进一步优选地，所述p-gp和BCRP共同底物为恩诺沙星、替米考星或环丙沙星中一种；P-gp的特异性抑制剂为维拉帕米，BCRP的特异性抑制剂为KO143。[0041]有益效果[0042]与现有技术相比，本发明的旨在构建共表达鸡源BCRP和鸡源P-gp转运体的MDCK细胞模型，并对其生物学功能进行研究，应用于高通量筛选和测试化合物的跨膜转运、外排、吸收转运机制、药物-药物相互作用，预测体内吸收和药物相互作用、新药设计及评价药物安全性等过程，以便更好的理解药物的吸收特性与药物的可展性之间的相关性，为鸡药物研发提供一个良好的体外筛选工具。[0043]1通过慢病毒转染这种技术建立的MDCK-chBCRPP-gp的细胞系可永久化的稳定高表达BCRP和P-gp蛋白，避免了随着时间的延长丢失外源基因的发生；[0044]2该细胞系易培养，增殖速度快，可无限扩大，性质稳定，可作为针对鸡BCRP和鸡P-gp共同底物研究的细胞模型；[0045]3可应用MDCK-chBCRPP-gp细胞模型预测BCRP和P-gp对共同底物的转运规律及BCRP和P-gp介导的药物一药物相互作用。附图说明[0046]图1为鸡cDNA文库特异性扩增产物电泳鉴别图，其中A图为ABCG2基因扩增图，B图为ABCB1基因扩增图，泳道1、2、3为目的基因PCR产物电泳条带，泳道M为MakerD5000的电泳条带；[0047]图2为PCR纯化产物链接线性化表达载体转化大肠杆菌扩增后的质粒经双酶切的鉴定图，其中，A图为ABCG2双酶切图，B图为ABCBl双酶切图，泳道1为质粒双酶切产物电泳条带，泳道M为MakerD25000的电泳条带。[0048]图3为含有目的基因的ABCG2的慢病毒颗粒转染293T细胞72h荧光照片，其中，a为含有BCRP的慢病毒颗粒转染293T细胞的荧光图，b为含有BCRP的慢病毒颗粒转染空白组的荧光图，c为含有P-gp的慢病毒颗粒转染293T细胞的荧光图，d为含有P-gp的慢病毒颗粒转染空白组的荧光图，其中，白色斑点为表达荧光的293T细胞；[0049]图4为RT-qPCR法检测验证MDCK-chBCRPP-gp细胞系过表达BCRP和P-gp基因图，其中A1-A6分别代表同时过表达BCRP和P-gp蛋白的6个不同的MDCK单克隆细胞株；[0050]图5为荧光法检测验证MDCK-chBCRPP-gp细胞系荧光蛋白图，其中，A为红色荧光蛋白图，B为绿色荧光蛋白图，C为同时表达红色荧光和绿色荧光的蛋白图；[0051]图6为WesternBlot检测验证MDCK-chBCRPP-gp细胞系过表达BCRP和p-gp蛋白图；[0052]图7为流式法检测MDCK-chBCRPP-gp细胞系荧光蛋白表达细胞所占的比例图；[0053]图8为MDCK细胞和MDCK-chBCRPP-gp细胞对BCRP经典底物米托蒽醌和P-gp经典底物盐酸阿霉素的药敏试验图；[0054]图9为MDCK细胞和MDCK-chBCRPP-gp细胞对鸡BCRP和鸡P-gp共同底物的转运，其中，A，恩诺沙星;B，替米考星;C，环丙沙星。具体实施方式[0055]本发明结合附图和实施例作进一步的说明。[0056]下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。[0057]实施例1含ABCG2基因重组慢病毒载体质粒的构建[0058]TRIZO1法从新鲜鸡肠道组织中提取总RNA，通过逆转录PCR获取cDNA文库，根据鸡ABCG2基因mRNA的编码序列设计PCR引物，并根据慢病毒表达载体Lenti-III-RFP-C在引物两端分别设计添加酶切位点EcoRI和BamHI扩增得到的目的序列如图1中A所示）；将载体进行EcoRI和BamHI双酶切得到线性化表达载体;将目的片段与线性化载体相连接，获得含有目的基因的慢病毒表达载体;转入大肠杆菌DH5a扩大培养提取质粒后进行EcoRI和BamHI双酶切鉴定如图2中A所示）。[0059]BCRP蛋白cDNA的PCR扩增引物为：[0060]BCRP-FP:GAGAATTCGCCACCATGGGAACTGCTCAAAACAACAG；[0061]BCRP-RP:CAGGATCCTGTGAACTTCCTCATAAACCGGAG〇[0062]实施例2含P-gp基因重组慢病毒载体质粒的构建[0063]从鸡新鲜的肠道组织提取总RNA，经反转录PCR获得cDNA序列；通过设计特异性引物以上述cDNA为模板特异性扩增得到目的基因（如图1中B所示）；设计特异性引物，以目的基因为模板对PCR产物进行5’端加attBl位点，3’端加attB2位点；按照Tranzymecloning试剂盒说明书（abmCatNo.E046进行BP反应将目的基因重组入入门载体pORF上；按照Fuzymecloning试剂盒说明书abmCatNo.E044进行LR反应将目的基因从入门载体pORF上重组到目的载体pLenti-III-CMV-GFP-2A-NE0上，从而得到含鸡P-gp的慢病毒表达载体pLenti-III-CMV-GFP-2A-NE0-P-gp;转入大肠杆菌DH5a扩大培养提取质粒，然后根据目的载体的特点选择NheI和Sail进行双酶切鉴定如图2中B所示）。[0064]实施例3含鸡BCRP的慢病毒表达载体和含鸡P-gp的慢病毒表达载体分别转染293T细胞[0065]将1.3-1.5\106的2931'细胞接种到10厘米细胞培养板中，37°：、5%〇2条件下培养，待细胞达到70-80%融合度时进行转染备用；[0066]取两个1.5mL离心管，其中一个离心管加入ImL无血清培养基、IOyg慢病毒表达载体1^1^卜111-1^^-〇80^、1^8的慢病毒包装质粒口1^11乜-?24和口1^11乜-?28，混匀，室温孵育5min;另一个离心管中将80yL的Lentifectin转染试剂稀释到ImL无血清培养基中，混勾，室温孵育5min;两管混匀，室温孵育20min后再加入4.5mL的无血清培养基，即得到混匀的DNA-LentiFectin复合物；将准备好的包装细胞293T中的培养基吸掉，加入DNA-LentiFectin复合物，轻柔涡旋平板使复合物分散，37°C、5%CO2条件下培养8-14h后，加入新鲜完全培养液更换旧培养液;转染48h后收集培养基，用0.45μπι滤膜过滤该培养基得到纯化的病毒液，离心收集病毒颗粒，获得浓缩的含鸡BCRP的慢病毒，并于-80°C冰箱保存备用；[0067]将上步中的IOyg慢病毒表达载体Lenti-III-RFP-C-BCRP换成慢病毒表达载体pLenti-III-CMV-GFP-2A-NE0-P-gp，含鸡P-gp的慢病毒表达载体转染293T细胞，获得浓缩的含鸡P-gp的慢病毒，并于_80°C冰箱保存备用。[0068]对上述慢病毒的质量检测，包括病毒滴度测定和病毒感染293T细胞后荧光鉴定。[0069]检测1，病毒滴度测定：[0070]按照abm公司的qPCRLentivirusTitrationKit指导说明进行病毒滴度的测定，具体方法为将纯化好的的病毒样品用IX磷酸盐缓冲盐水稀释至106_108IUmL的范围，取2μL稀释好的慢病毒样品加入18μ1的病毒裂解缓冲液并在室温下孵育3min得到病毒裂解液，按照试剂盒说明设置病毒裂解液组和两个阳性标准品对照组STDUSTD2,每组设置三个复孔，并加入相应的试剂;在荧光定量PCR仪上按照说明的反应程序计算得到各Ct值，按照公式病毒滴度=5Xl〇V23Ctx-CtlACt2-Ctl计算，其中Ctx为待测病毒液的平均Ct值，Ct1为STDl平均Ct值，Ct2为STD2平均Ct值，STDl和STD2均为试剂盒中提供的样品。[0071]结果:含BCRP目的基因的慢病毒成功转化293T细胞，并获得滴度为2.77xl06IUmL的慢病毒;含P-gp目的基因的慢病毒成功转化293T细胞，并获得滴度为1.33xl07IUmL的慢病毒。[0072]检测2病毒感染293T细胞后荧光鉴定[0073]将293T细胞接种于24孔板中，待融合度50%-60%，以MOI为10加入纯化好的慢病毒，37°C、5%C02培养箱中培养72h后用荧光显微镜观察荧光蛋白的表达情况，其中，含BCRP目的基因的病毒载体表达红色荧光如图3中a所示），含P-gp目的基因的病毒载体表达绿色荧光（如图3中c所示），其中图3中b和c均为空白对照组。[0074]实施例4MDCK细胞抗生素敏感性测定[0075]将MDCK细胞接种于24孔细胞板中，每孔5XIO4个细胞，待融合度40%，更换嘌呤霉素筛选培养基，浓度梯度为〇、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2ygmL，每梯度3个复孔，设置6个空白对照，置于37°C、5%C02培养箱中培养，每隔两天更换培养液，观察各个浓度下细胞的死亡情况;经微镜下观察发现，3天之内在I.Oygml浓度下，细胞刚好全部死亡，所以本次试验的最适致死浓度为I.Oygml。[0076]将MDCK细胞接种于24孔细胞板中，每孔5XIO4个细胞，待融合度40%，更换盐酸新霉素筛选培养基，浓度梯度为400、600、800、1000、1200、1400ygmL，每梯度3个复孔，设置6个空白对照，置于37°C、5%⑶2培养箱中培养，每隔两天更换培养液，观察各个浓度下细胞的死亡情况;经微镜下观察发现，10天之内在1200ygml浓度下，细胞刚好全部死亡，所以本次试验的最适致死浓度为1200ygml。[0077]实施例5含鸡BCRP的慢病毒感染MDCK细胞[0078]过夜培养长至融合度50-60%的MDCK细胞用于病毒感染;根据测得的慢病毒滴度和预实验测定的最适MOI值本次试验MOI=50加入适当体积的慢病毒液，感染36h观察荧光情况及细胞生长状态，若发现感染孔中没有荧光或细胞生长状态不佳，则重新准备细胞铺板;感染72h后，荧光显微镜下观察荧光表达情况，对照孔中应无荧光;随后，更换成含有1.0ugml的新鲜培养液，37°C、5%CO2条件下继续培养细胞，每2-3天更换一次筛选培养基，药筛2周可见有抗性的克隆出现，停药培养，使其逐渐增大，采用有限稀释法筛选单细胞克隆。[0079]实施例6含鸡P-gp的慢病毒感染MDCK细胞[0080]培养实施例5所得的过表达BCRP的MDCK单细胞克隆株至融合度50%-60%用于病毒感染，根据测得的慢病毒滴度和预实验测定的最适MOI值本次试验MOI=50加入适当体积的慢病毒液，感染36h观察荧光情况及细胞生长状态，若发现感染孔中没有荧光或细胞生长状态不佳，则重新准备细胞铺板;感染72h后，荧光显微镜下观察荧光表达情况，对照孔中应无荧光;随后，更换成含有1200ugml盐酸新霉素的新鲜培养液，37°C、5%C02条件下继续培养细胞，每2-3天更换一次筛选培养基，药筛2周可见有抗性的克隆出现，停药培养，使其逐渐增大，采用有限稀释法筛选单细胞克隆。[0081]实施例7单克隆筛选：[0082]用胰酶消化实施例6得到的细胞，然后将细胞液稀释至密度为lOOOcellml的单细胞悬液，将上述细胞液接种于96孔板的第一列，0.2ml孔，从中吸取0.1ml细胞悬液接种于第二列并加入〇.Iml培养液混合，从第二排中吸取0.Iml接种于第三列并加入0.Iml培养液混合，一直到最后一列。将稀释好的细胞放于显微镜下观察，挑选出只有单个细胞的孔并做好标记，待单个细胞长成细胞团后，挑选出生长较好的单克隆细胞团。移到24孔板作扩大培养，本实验共挑选出了6孔生长较好的单克隆细胞团，依次编号A1-A6。[0083]实施例8BCRP和P-gp基因插入情况检测[0084]提取MDCK-chBCRPP-gp细胞的RNA，MDCK细胞的RNA为阴性空白对照，扩增检测BCRP和P-gp基因的表达水平（如图4所示），挑选出过表达效果最好的一孔A6,再将其扩大培养成稳定细胞模型，并命名为MDCK-chBCRPP-gp，随后对其进行BCRP和P-gp蛋白表达的验证。[0085]实施例9验证[0086]一、荧光法检测MDCK-chBCRPP-gp细胞系荧光蛋白表达情况[0087]将MDCK-chBCRP细胞接种在6孔板中的细胞爬片上，过夜培养待细胞融合度达60%-70%时弃掉培养基，直接置于荧光显微镜下观察如图5所示），A为红色荧光，B为绿色荧光，C为叠加图片。[0088]二、WesternBlot法检测BCRP和P-gp蛋白表达情况[0089]提取MDCK-chBCRPP-gp细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度;配制10%SDS-PAGE胶，加入约IOOyg蛋白进行电泳。电泳完毕后，使用湿转法转膜；5%脱脂奶粉室温封闭lh，bs-0662RABCG2—抗（1:2000、ABCB1—抗（1:2000和GAI3DH—抗（1:20004°C轻摇孵育过夜。TBSTTBS+0.1%Tween—20洗膜三次后二抗（1:100,000室温孵育Ih，彻底洗膜后使用ECL发光试剂显色，曝光如图6所示）。[0090]三、流式法检测MDCK-chBCRPP-gp细胞系荧光蛋白表达细胞所占的比例[0091]将MDCK-chBCRPP-gp细胞进行扩大培养后胰酶消化收集细胞悬液，同时收集MDCK细胞悬液作为阴性对照，将细胞悬液用PBS清洗三遍后用流式仪检测细胞荧光蛋白的荧光强度如图7所示），其中红色荧光蛋白流式检测为FLl通道，绿色荧光蛋白流式检测为FL41通道。Q2象限表示同时表达红色和绿色荧光的双阳性细胞。PlO和P50分别代表10代和50代的细胞，结果表明，双阳性细胞在10代和50代分别占总细胞的95.2%和94.4%。（如图7所示。[0092]四、米托蒽醌和盐酸阿霉素药敏试验：[0093]将MDCK-chBCRPP-gp细胞和母源细胞MDCK以IX104孔的密度接种在在96孔板中，过夜培养24小时后待细胞融合度达60%-70%时弃掉培养基，每孔加入含不同浓度米托蒽醌Ο.I、I、2、4、8、10、16、32μΜ的培养基IOOyL继续培养48小时，之后弃掉培养基每孔加入IOOyL新鲜培养基和20yL、5mgml的MTT继续孵育4小时，之后弃去培养基不洗，每孔加入DMSO150yL，避光震荡IOmin后用酶标仪于490nm波长处检测吸光值㈤，利用公式细胞存活率％=实验组平均㈤值阴性对照组平均㈤值）X100%计算细胞的存活率，三次独立实验后用SPSS分析计算米托蒽醌的IC50。同样的实验过程用于测定盐酸阿霉素的IC50,其中盐酸阿霉素的浓度梯度为0.1、0.2、0.5、1、2、4、6、8以1如图8所示）。结果表明1«〇细胞比MDCK-chBCRPP-gp细胞对米托蒽醌和盐酸阿霉素更敏感，表明MDCK-chBCRPP-gp中的BCRP和P-gp蛋白能将相应的底物外排。[0094]六、米托蒽醌和Rho123蓄积实验[0095]将MDCK-chBCRPP-gp细胞和母源细胞MDCK以IXIO5孔的密度铺在24孔板中，过夜培养24小时后待细胞融合度达90%时弃掉培养基，每孔加入米托蒽醌或米托蒽醌与各种抑制剂的混合物300yL，其中，米托蒽醌的工作浓度为5μΜ，各种抑制剂的工作浓度KO143和维拉帕米均为5μΜ，孵育60min后胰酶消化收集细胞悬液，PBS清洗三遍细胞悬液后用流式检测细胞内药物的蓄积量，米托蒽醌流式检测为FL4通道。同样的试验步骤用于蓄积实验，其中，Rh〇123的工作浓度为5μΜ，各种抑制剂K0143和维拉帕米）的工作浓度均为5μΜ。结果表明，加抑制剂的组对底物的蓄积量大于不加抑制剂组，表明MDCK-chBCRPP-gp中的BCRP和P-gp蛋白能将相应的底物外排。[0096]实施例10MDCK-chBCRPP-gp细胞模型应用于鸡BCRP和鸡P-gp共同底物转运规律的研究[0097]将MDCK和MDCK-chBCRPP-gp以IXIO5孔接种至Transwell内；每隔两天换一次液，一周左右形成致密的细胞单层后，弃去培养基更换为转运液HBSS;转运实验时，将内外两侧的培养基换成HBSS液孵育SOmin13AP-BL侧的药物的转运:将500yL药物与抑制剂混合物其中P-gp的特异性抑制剂为维拉帕米，BCRP的特异性抑制剂为K0143加入AP侧，1500yL只含抑制剂的转运液加入B侧;BL-AP侧的药物的转运:将1500yL含有药物与抑制剂的转运液加入BL侧，150yL的只含抑制剂的转运液加入到A侧。分别在转运4小时于接受室吸取转运液。用高效液相法检测转运的药物。[0098]根据公式Papp=dQdt·A·Co分别计算药物在MDCK和MDCK-chBCRPP-gp上的表观渗透系数，A为表面积此实验中为0.33cm2，dQ代表dt时间内药物从供药侧向取样侧的转运速率，Co为供液侧药物的初始浓度。[0099]根据公式ER=PappBL-APPappAP-BL计算转运药物的外排率。式中ER为外排率（Effluxrate，其中PappBL-AP为底侧到顶测的表观渗透系数，PappAP-BL为顶测到底侧的表观渗透系数，根据公式NER=ERMDCK-chBCRPP-gpERMDCK计算药物的净外排率。结果表明对于恩诺沙星的转运，低浓度2μΜ时BCRP转运占优势，高浓度ΙΟμΜ时BCRP的转运基本饱和，P-gp的转运活动仍比较活跃，更高浓度50μΜ时P-gp和BCRP转运均达到饱和如图9中A所示）。对于环丙沙星的的转运，低浓度1ΟμΜ时，P-gp转运占优势，高浓度50μΜ时，P-gp的转运基本饱和，BCRP的转运活动仍比较活跃（如图9中B所示）。对于替米考星的转运，低浓度1〇μΜ时，P-gp和BCRP对其转运能力相当，高浓度50μΜ时，BCRP的转运基本饱和P-gp的转运活动仍比较活跃如图9中C所示）。[0100]从上述结果中可以看出，本发明的细胞模型可研究BCRP和P-gp共同底物在不同的浓度下与BCRP和P-gp的亲和力，更准确预测所研究的分子化合物在体内的代谢情况，从而在药物研发阶段更准确的判断化合物的成药性以及在药物的上市阶段准确地指导临床用药。

权利要求：CN108330100A权利要求书13页1.一种稳定共表达鸡源BCRP和P-gp转运体的MDCK细胞模型，其特征在于，分别构建含鸡BCRP和鸡P-gp的慢病毒表达载体，然后分别转染293T细胞得到含鸡BCRP和鸡P-gp的慢病毒，再依次感染MDCK细胞，依次经含lygmL的嘌呤霉素和120〇ugml新霉素培养液筛选后得到稳定表达鸡BCRP和鸡P-gp转运体的MDCK细胞模型，即MDCK-chBCRPP-gp。2.基于权利要求1所述的稳定共表达鸡源BCRP和P-gp转运体的MDCK细胞模型的构建方法，其特征在于:包括以下步骤：步骤1，构建含鸡BCRP的慢病毒表达载体从鸡新鲜的肠道组织提取总RNA，经反转录PCR获得cDNA序列；通过设计含有EcoRI和BamHI两个酶切位点的特异性引物以上述cDNA为模板特异性扩增得到目的基因；通过EcoRI和BamHI两个酶切位点双酶切慢病毒表达载体Lenti-III-RFP-C以得到线性化的载体;将目的基因与线性化慢病毒表达载体通过EcoRI和BamHI两个酶切位点连接后转入大肠杆菌DH5a中，得到含鸡BCRP的慢病毒表达载体Lenti-III-RFP-C-BCRP;步骤2，构建含鸡P-gp的慢病毒表达载体从鸡新鲜的肠道组织提取总RNA，经反转录PCR获得cDNA序列；通过设计第一轮特异性引物以上述cDNA为模板特异性扩增得到目的基因；设计第二轮特异性引物，以目的基因为模板对PCR产物进行5’端加attBl位点，3’端加attB2位点;按照Tranzymecloning试剂盒说明书（abmCatNo.E046进行BP反应将目的基因重组入入门载体p〇RF上；按照Fuzymecloning试剂盒说明书abmCatNo.E044进行LR反应将目的基因从入门载体pORF上重组到目的载体pLenti-III-CMV-GFP-2A-NEO上，从而得到含鸡P-gp的慢病毒表达载体pLenti-III-CMV-GFP-2A-NE0-P-gp；步骤3，含鸡BCRP的慢病毒表达载体和含鸡P-gp的慢病毒表达载体分别转染293T细胞将含鸡BCRP的慢病毒表达载体Lenti-III-RFP-C-BCRP和含鸡P-gp的慢病毒表达载体pLenti-III-CMV-GFP-2A-NE〇-P-gp分别与包装质粒pLenti-P2A、pLenti_P2B组成三质粒慢病毒包装系统转染293T细胞，于37°C、5%C02细胞培养箱中培养8-14h后，换成完全培养液继续培养，转染48h后收集培养液，过滤离心后分别得到浓缩的含鸡BCRP的慢病毒和含鸡P-gp的慢病毒，并于_80°C冰箱中保存备用；步骤4，含鸡BCRP的慢病毒感染MDCK细胞培养MDCK细胞至融合度50%_6〇%，加入步骤3所得的含鸡BCRP的慢病毒，感染72h后，胰酶消化细胞重新接种于24孔板中培养至融合度40%,然后在培养基中加入1.〇ygml的噪吟霉素进行抗性筛选，持续筛选2周后，收集感染细胞，备用；步骤5，含鸡P-gp的慢病毒感染MDCK细胞培养步骤4所得的MDCK细胞至融合度5〇%_6〇%，加入步骤3所得的含鸡p-gp的慢病毒，感染72h后，胰酶消化细胞重新接种于24孔板中培养至融合度4〇%，然后在培养基中加入1200ygml新霉素进行抗性筛选，持续筛选2周后，收集感染细胞，备用；步骤6,单克隆筛选将步骤5所得的感染细胞稀释至密度为lOOOcellml的单细胞悬液，并接种于96孔板的第一列，0.2ml孔，从第一列吸取0.1mL单细胞悬液接种于第二列并加入L1mL培养液混合，从第二列中吸取0_1mL接种于第三列并加入0.1mL培养液混合，一直到最后一列，再将2CN108330100A权利要求书23页最后一列的细胞放于显微镜下观察，挑选出只有单个细胞的孔并做好标记，待单个细胞长成细胞团后，挑选出生长较好的单克隆细胞团，移到24孔板作扩大培养，分别取样裂解细胞，并逐个进行RT-qPCR检测，挑选出过表达效果最好的一孔，再将其扩大培养成稳定细胞模型；步骤7,验证对步骤6的细胞模型通过WesternBlot和荧光检测的方法进行蛋白表达的验证，通过对BCRP经典底物米托蒽醌和P-gp经典底物盐酸阿霉素的敏感性及对米托蒽醌和Rh〇123蓄积能力进行蛋白功能的确证。3.根据权利要求2所述的稳定共表达鸡源BCRP和P-gp转运体的MDCK细胞模型的构建方法，其特征在于,步骤1中特异性引物为BCRP-FP:GAGAATTCGCCACCATGGGAACTGCTCAAAACAACAG；BCRP-RP：CAGGATCCTGTGAACTTCCTCATAAACCGGAG〇4.根据权利要求2所述的稳定共表达鸡源BCRP和P-gp转运体的MDCK细胞模型的构建方法，其特征在于，步骤2中两轮PCR反应的特异性引物依次为：第一轮特异性引物为P-gp-FPl:GCCACCATGCATTCTGAAGATGAAAAGC；P-gp-RP1:CATGTTGCATGACCCACTTTGAAC；第二轮特异性引物为P-gp-FP2:GGGGACAACTTTGTACAAAAAAGTTGGCGCCACCATGCATTCTGAAGATGAAAAGCP-gp-RP2:GGGGACAACTTTGTACAAGAAAGTTGGGCATCAAGCGTAGTCTGGGACG05·根据权利要求2所述的稳定共表达鸡源BCRP和P-gp转运体的MDCK细胞模型的构建方法，其特征在于，步骤3含鸡BCRP的慢病毒表达载体和含鸡P-gp的慢病毒表达载体分别转染293T，包括以下步骤：第一步，将1_3-1.5乂106的2931'细胞接种到10厘米细胞培养板中，37°：、5%〇2条件下培养，待细胞达到70-80%融合度时进行转染备用；第二步，取两个1·5mL离心管，其中一个离心管加入ImL无血清培养基、10wg慢病毒表达载体Lenti-III-RFP-C-BCRP、10Ug的慢病毒包装质粒pLenti-P2A和pLenti-P2B，混匀，室温孵育5min;另一个离心管中将80yL的Lentifectin转染试剂稀释到ImL无血清培养基中，混匀，室温孵育5min;两管混匀，室温孵育20min后再加入4.5mL的无血清培养基，即得到混匀的DNA-LentiFectin复合物;将准备好的包装细胞293T中的培养基吸掉，加入DNA-LentiFectin复合物，轻柔涡旋平板使复合物分散，37°C、5%C〇2条件下培养8-14h后，加入新鲜完全培养液更换旧培养液;转染4Sh后收集培养基，用0.45μπι滤膜过滤该培养基得到纯化的病毒液，离心收集病毒颗粒，获得浓缩的含鸡BCRP的慢病毒，并于-8TC冰箱保存备用；第三步，将第二步操作中的10Ug慢病毒表达载体Lenti-III-RFP-C-BCRP换成慢病毒表达载体pLenti-III-CMV-GFP-2A-NE0-P-gp，含鸡P-gp的慢病毒表达载体转染293Τ细，重复第二步，获得浓缩的含鸡P-gp的慢病毒，并于-801：冰箱保存备用。3CN108330100A权利要求书33页6.基于权利要求1所述的稳定共表达鸡源BCRP和P-gp转运体的MDCK细胞模型在鸡BCRP和鸡P-gp共同底物的研宄上的应用。7.根据权利要求6所述的稳定共表达鸡源BCRP和P-gp转运体的MDCK细胞模型在鸡BCRP和鸡P-gp共同底物的研宄上的应用，其特征在于，在P-gp和BCRP共同底物的双向转运试验中分别加入P-gp和BCRP的特异性抑制剂，从而通过抑制一种蛋白的外排来观察另一种蛋白的外排活动，计算被测药物在MDCK和MDCK-chBCRPP-gp细胞上的表观渗透系数和外排率，以及药物的净外排率，通过不同抑制剂添加条件下得净外排率的大小来预测BCRP和P-gp对共同底物的转运规律。8.根据权利要求7所述的稳定共表达鸡源BCRP和P-gp转运体的MDCK细胞模型在鸡BCRP和鸡P-gp共同底物的研宄上的应用，其特征在于，所述P-gp和BCRP共同底物为恩诺沙星、替米考星或环丙沙星中一种；P-gP的特异性抑制剂为维拉帕米，BCRP的特异性抑制剂为K0143。4

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