申请/专利权人：苏州百源基因技术有限公司

申请日：2016-12-29

公开（公告）日：2017-05-24

公开（公告）号：CN106701946A

主分类号：C12Q1/68(2006.01)I

分类号：C12Q1/68(2006.01)I

优先权：

专利状态码：失效-发明专利申请公布后的驳回

法律状态：2021.10.01#发明专利申请公布后的驳回;2017.06.16#实质审查的生效;2017.05.24#公开

摘要：本发明提供用于检测JAG2基因SNP位点rs2238286基因型的试剂盒，所述试剂盒包括引物对和PCR检测反应试剂；其中，所述引物对为（1）或（2）中的一种：（1）上游引物：JAG2‑F  5'‑ AGGAGCTAGGGGGAGAGAAGAC‑3'，下游引物：JAG2‑R  5'‑ AGGGGTCACCTTGGTGGTTA‑3'；（2）与（1）中的互补序列。本发明的试剂盒能够准确检测JAG2基因SNP位点rs2238286的基因型，灵敏度高，特异性好，检测迅速；应用本发明的方法对JAG2基因SNP位点rs2238286基因型的分型与测序结果完全一致，能够用于非综合征唇腭裂的易患性分析。

主权项：用于检测JAG2基因SNP位点rs2238286基因型的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括引物对和PCR检测反应试剂；其中，所述引物对为（1）或（2）中的一种：（1）上游引物：JAG2‑F 5'‑ AGGAGCTAGGGGGAGAGAAGAC‑3'下游引物：JAG2‑R 5'‑ AGGGGTCACCTTGGTGGTTA‑3'；（2）与（1）中的互补序列。

全文数据：用于检测JAG2基因SNP位点rs2238286基因型的试剂盒技术领域[0001]本发明涉及用于检测JAG2基因突变的试剂盒，具体涉及用于检测JAG2基因SNP位点rs2238286基因型的方法。背景技术[0002]JAG2基因是NOTCH信号通路的配体之一，它的主要作用是参与了次级腭的形成和发育过程，被认为是唇腭裂的候选基因之一。JAG2基因rs2238286n.66+11354AG位点位于该基因的5’端附近，在研究中该位点AG、GG基因型表现出与非综合征性唇腭裂有显著性相关性。[0003]作为常见的出生缺陷和颅面发育缺陷，唇腭裂是一种复杂的异质性疾病，国际上将其分为综合征性（syndromiccleftliporpalate，SCLP和非综合征性唇腭裂〇1〇11-syndromiccleftliporpalate，NSCLP。全球唇腭裂的发生率为3-2210000,而我国的发生率约为1.82100LNSCLP的发病原因有很多，其中遗传和环境的影响占据了主要作用。研究发现许多信号通路参与了唇腭的发育，不同染色体区间在唇腭裂发病中具有一定作用。目前已知的NSCLP易感区有Iq32,2p，2q，3q27-28,4q，6p23-p25,8q24,9q21，12pll，14q21_24,16q24和19ql3,可能的易感基因有IRF6、SATB2、TP63、FQXE1、PVRL1、MSX1、GABRB3、CRISPLD2、MAFB和ABCA4等。[0004]高分辨率恪解曲线highresolutionmelting,HRM的分析原理是在常规聚合酶链式反应PCR过程中饱和荧光染枓与双链DNA结合，当通过加热升温使DNA双链解离时，荧光染料从局部解链的DNA分子上释放，由于突变、SNP位点双链碱基间不匹配会使双链DNA在此位点首先解开，通过实时监测升温过程中的荧光强度，从荧光强度与时间轴曲线上便可判断是否存在突变或SNP，而且不同位点、杂合子与否、GC含量、扩增子长度等都会影响熔解曲线的峰形。所以，HRM分析能够有效区分不同突变位点、SNP位点和拥有不同GC含量的扩增片段。发明内容[0005]本发明提供了用于检测JAG2基因突变的试剂盒，具体提供了用于检测JAG2基因SNP位点rs2238286基因型的试剂盒，该试剂盒可用于非综合唇腭裂易患性的辅助分析。[0006]本发明的第一个目的是提供用于检测JAG2基因SNP位点rs2238286基因型的试剂盒，所述试剂盒包括引物对和PCR检测反应试剂;其中，所述引物对为1或2中的一种：1上游引物:JAG2-F5’-AGGAGCTAGGGGGAGAGAAGAC-3’下游引物:JAG2-R5’-AGGGGTCACCTTGGTGGTTA-3’；2与（1中的互补序列。[0007]作为优选，所述PCR检测反应试剂包括含EvaGreen的Green-2-GoqPCRMastermix。[0008]作为优选，所述PCR扩增时的反应体系为：Green-2-GoqPCRMastermix含EvaGreen5μ1引物FIOyMΟ.ΐμΐ引物RIOyMΟ.ΐμΐ模板50ngyl0.5μ1CldH2O4.3μ1总体积lOul。[0009]作为进一步优选，所述试剂盒还包括标准品，所述标准品为重组阴性质粒和重组阳性质粒，所述重组阴性质粒的核苷酸序列为序列表SEQIDNo.1，所述重组阳性质粒的核苷酸序列为序列表中SEQIDNo.2。[0010]本发明的第二个目的是提供一种检测JAG2基因SNP位点rs2238286基因型的方法，步骤如下：1构建重组阴性质粒和重组阳性质粒:所述重组阴性质粒的核苷酸序列为序列表中SEQIDNo.1，所述重组阳性质粒的核苷酸序列参见序列表中SEQIDNo.2;2构建PCR扩增时的引物对，所述引物对为a或b中的一种：a、上游引物:JAG2-F5’-AGGAGCTAGGGGGAGAGAAGAC-3’下游引物:JAG2-R5’-AGGGGTCACCTTGGTGGTTA-3’；b、与a中的互补序列；3提取待测样本的外周血基因组DNA，对重组阴性质粒、重组阳性质粒和待测样本的DNA均使用步骤2所述引物，且在同一条件下进行PCR扩增和HRM分析，收集数据；作为优选，所述HRM分析的条件为:94°C90s;60°C30s;83-94°C收集数据，温度上升速率为0.06°Cs;4根据收集数据绘制高分辨率熔解曲线，根据重组阴性质粒、重组阳性质粒的熔解曲线判断待测样本JAG2基因SNP位点rs2238286的基因型：与重组阴性质粒的熔解曲线重合则JAG2基因SNP位点rs2238286的基因型为AA;与重组阳性质粒的熔解曲线重合则JAG2基因SNP位点rs2238286的基因型为GG;在重组阴性质粒和重组阳性质粒之间的则JAG2基因SNP位点rs2238286的基因型为AG。[0011]作为优选，所述PCR扩增时的反应体系为：Green-2-GoqPCRMastermix含EvaGreen5μ1引物FIOyMΟ.ΐμΐ引物RIOyMΟ.ΐμΐ模板50ngyl0.5μ1CldH2O4.3μ1总体积1〇μ1。[0012]作为优选，所述PCR扩增时的反应条件为：94°C预变性3min;94°C变性10s;60°C退火延伸20s;40个循环。[0013]本发明的第三个目的是提供上述试剂盒的使用方法，步骤如下：1提取待测样本的外周血基因组DNA，对重组阴性质粒、重组阳性质粒和待测样本的DNA均使用相同引物，且在同一条件下进行PCR扩增和HRM分析，收集数据；所述HRM分析的条件为:94°C90s;60°C30s;83-94°C收集数据，温度上升速率为0.06〇Cs；2根据收集数据绘制高分辨率熔解曲线，根据重组阴性质粒、重组阳性质粒的熔解曲线判断待测样本JAG2基因SNP位点rs2238286的基因型：与重组阴性质粒的熔解曲线重合则JAG2基因SNP位点rs2238286的基因型为AA;与重组阳性质粒的熔解曲线重合则JAG2基因SNP位点rs2238286的基因型为GG;在重组阴性质粒和重组阳性质粒之间的则JAG2基因SNP位点rs2238286的基因型为AG。[0014]本发明的第四个目的是提供上述试剂盒在制备辅助诊断非综合征唇腭裂的试剂中应用。[0015]本发明的试剂盒能够准确检测JAG2基因SNP位点rs2238286的基因型，灵敏度高，特异性好，检测迅速;应用本发明的方法对JAG2基因SNP位点rs2238286基因型的分型与测序结果完全一致，能够用于非综合征唇腭裂的易患性分析。附图说明[0016]附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：图1为本发明的HRM方法灵敏度实验结果；图2为样本用本发明的HRM方法分析结果；图3为样本的JAG2rs2238286n.66+11354AG位点的测序结果;其中a代表野生型序列，b代表纯合突变型序列，c为杂合突变序列。具体实施方式[0017]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。本申请所用引物和所用序列合成及测序工作均由生工生物工程上海股份有限公司完成。[0018]实施例IJAG2rs2238286标准品的制备要建立HRM分析方法，首先必须制备方法所需的外部标准品，标准品应包含高度保守和特异性的序列，要保证反应的高特异性。本发明合成包含JAG2rs2238286n.66+11354AG位点的野生型和纯合突变型DNA序列，利用基因重组技术将其克隆到pMD18-T载体中，构建出重组质粒pMD18-T-rs2238286的野生型和纯合突变型，并进行相应的PCR鉴定和测序鉴定，最后经定量后作为待建立方法的标准品，野生型重组质粒为重组阴性质粒，纯合突变型重组质粒为重组阳性质粒，为下一步的方法及评估奠定基础。[0019]一、pMD18-T-rs2238286重组阴性质粒和重组阳性质粒的构建和转化1.合成JAG2rs2238286η.66+11354AG野生型和纯合突变型DNA序列，本发明合成的序列长250bp，序列如下：1野生型序列ACCCAGCTCCGGGCACAGGGCAAATTTGCGAGAGGAGCTAGGGGGAGAGAAGACAGCTCAGTTATCATGGGGATGGGTTGAGGACCCCTCTGGACCATATGGGGATCTTTAACCACCAAGGTGACCCCTAGCTCTGGAAAGGACCGTGCTCACTGGAGGAGAGGAAGGTGCCATTGGTTTTGACCCTGTGGAGGAGCTGCGAGGTCACCCAGGGAGAGGGCAAGGAGGTGACCGCAGAGGATGGGGTGTG2纯合突变型序列ACCCAGCTCCGGGCACAGGGCAAATTTGCGAGAGGAGCTAGGGGGAGAGAAGACAGCTCAGTTATCATGGGGATGGGTTGAGGACCCCTCTGGACCATGTGGGGATCTTTAACCACCAAGGTGACCCCTAGCTCTGGAAAGGACCGTGCTCACTGGAGGAGAGGAAGGTGCCATTGGTTTTGACCCTGTGGAGGAGCTGCGAGGTCACCCAGGGAGAGGGCAAGGAGGTGACCGCAGAGGATGGGGTGTG其中标有下划线的碱基为基因突变位点。[0020]2.连接反应:将上述合成的DNA片段与pMD18-T进行连接，采用如下连接体系进行配制：PMD18-TIyLDNA2yLSolutionI5yLCldH2O2yL总体积l〇uL。[0021]配制完成后置于16°C进行过夜连接反应。[0022]3.pMD18-T-rs2238286质粒的转化以及PCR鉴定1从-80°C的超低温冰箱中取出冻存的DH5a感受态细胞，置于冰盒上使其解冻；2取步骤2得到的连接产物IOyL加入50yL的DH5a感受态细胞中，轻轻摇匀后置冰浴30分钟；342°C水浴热激90秒，热激后立即置冰上冷却2min;4于1.5mlEP管中加入预冷的Iml的不含抗性的LB液体培养基吹打混匀后，37°C120转分轻摇培养90min;5将上述培养液短暂离心吸去900μ1后取剩余的ΙΟΟμΙ涂布于含Amp抗生素的LB平板上，正面向上放置30min，待菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿37°C恒温箱培养过夜；6从平板上挑取单克隆菌落于500yLAmp抗性LB液体培养基的1.5mlEP管中，37°C220rpm振荡培养5-6小时；7取IyL作为模板进行菌液PCR鉴定。将鉴定为阳性的菌液加入到20ml的LB液体培养基中进行扩摇；8用引物JAG2-F和JAG2-R扩增上述稀释菌液，PCR产物采用2%琼脂糖凝胶电泳，通过检测PCR产物鉴定阳性转化子。[0023]弓丨物序列为HRM分析所用引物，序列如下：上游引物:JAG2-F5’-AGGAGCTAGGGGGAGAGAAGAC-3’下游引物:JAG2-R5’-AGGGGTCACCTTGGTGGTTA-3’体系如下：10XPCRbuffer2yLdNTP2.5μΜ2yL引物F5yM1.5yL引物R5yM1.5yL模板2yLTaq酶（5U0.5yLCldH2O10.5yL总体积20yL。[0024]扩增程序反应条件：94°C预变性5min;94°C30s、60°C30s、72°C30sec，35个循环；72°ClOmin。[0025]提取重组阴性质粒和重组阳性质粒采用北京百泰克公司生产的质粒制备试剂盒提取重组质粒，测定浓度和纯度，同时吸取一部分纯化质粒送至上海生物工程有限公司进行测序，确定插入片段的基因序列与目的序列一致。[0026]二、标准品的获取和定量1将步骤一得到的冻存的含有重组质粒pMD18-T-rs2238286的大肠杆菌DH5aΙΟΟμΙ接种于15ml氨苄抗性的LB液体培养基中，37°C220rpm培养14-16h;2采用北京百泰克生物科技有限公司生产的质粒制备试剂盒提取重组质粒；3利用北京百泰克生物科技有限公司的超微量紫外可见分光光度计ND5000对提取的质粒测定浓度，根据A26QA28Q判断质粒的纯度。A26QA28Q=1·78〇[0027]实施例2HRM-PCR检测JAG2rs2238286方法的建立一、待测样本DNA的制备提取30例样本的外周血基因组DNA，用作JAG2基因PCR扩增的模板。具体提取方法如下：1取Iml全血，加入3mlTE，颠倒混勾后静置IOmin，8000rpm离心5分钟，弃上清液；2重复上述步骤2-3次至沉淀为白色；3加入900μ110%SDS和10μ110mgml蛋白酶K，55°C水浴Ih;4将离心管冷却至室温，加入等体积的酚氯仿异戊醇（25:24:1混匀，12000rpm离心IOmin;5小心吸取上清后再加入等体积的酚氯仿异戊醇（25:24:1混匀，12000rpm离心IOmin;6取上清，加入两倍体积的无水乙醇，上下颠倒混匀，12000rpm离心IOmin，弃上清；7加500μ170%的乙醇洗涤沉淀，短暂离心后弃上清，开盖干燥至乙醇完全挥发；8加50μ1双蒸水或TE溶解DNA中，-20°C保存。[0028]二、特异性引物的设计与合成本发明通过对NCBI数据库中JAG2rs2238286基因序列进行检索，选取适合设计引物的片段序列为靶目标，设计了一组HRM-PCR引物。[0029]本发明选取的扩增序列如下：其中标有下划线的碱基为基因突变位点。[0030]设计的引物序列如下：上游引物:JAG2-F5’-AGGAGCTAGGGGGAGAGAAGAC-3’下游引物:JAG2-R5’-AGGGGTCACCTTGGTGGTTA-3’扩增片段大小为:97bp。扩增的核苷酸序列为：三、HRM-PCR反应体系和反应条件分别以待测样本DNA、重组阴性质粒和重组阳性质粒为模板，以上述引物JAG2-F和JAG2-R为扩增引物，采用下述体系和反应条件进行PCR扩增和HRM分析。[0031]PCR体系：Green-2-GoqPCRMastermix含EvaGreen5μ1引物FIOyMΟ.ΐμΐ引物RIOyMΟ.ΐμΐ模板50ngyl0.5μ1CldH2O4.3μ1总体积lOul。[0032]其中引物采用JAG2-F和JAG2-R，HRM-PCR采用生工生物（上海），Green-2-GoqPCRMastermix试剂盒。HRM分析仪为百源基因ASA-9600实时荧光定量PCR仪。[0033]PCR扩增程序：94°C预变性3min;94°C变性IOs;60°C退火延伸20s;40个循环；HRM分析：94°C90s60°C30sec83-94°C收集数据，温度上升速率为0.06°Cs。[0034]四、结果分析根据收集数据绘制高分辨率熔解曲线，根据重组阴性质粒、重组阳性质粒的熔解曲线判断待测样本JAG2基因SNP位点rs2238286的基因型：与重组阴性质粒的熔解曲线重合则JAG2基因SNP位点rs2238286的基因型为AA;与重组阳性质粒的熔解曲线重合则JAG2基因SNP位点rs2238286的基因型为GG;在重组阴性质粒和重组阳性质粒之间的则JAG2基因SNP位点rs2238286的基因型为AG。[0035]五、灵敏度实验将重组阳性质粒和重组阴性质粒均稀释至50ngAU后，将二者混合进行梯度稀释，重组阳性质粒比例依次为50%、25%、12.5%、5%、2%和1%，按照上述HRM-PCR反应体系和参数进行扩增，分析突变检出范围，即灵敏度。[0036]反应体系如下：Green-2-GoqPCRMastermix含EvaGreen5μ1引物FIOyMΟ.ΐμΐ引物RIOyMΟ.ΐμΐ模板50ngyl0.5μ1CldH2O4.3μ1总体积lOul。[0037]PCR扩增程序：94°C预变性3min;94°C变性1〇8;60°：退火延伸2〇8HRM分析：94°C90s60°C30sec83-94°C收集数据，温度上升速率为0.06°Cs。[0038]结果参见图I，实验数据显示，当重组阳性质粒与重组阴性质粒体积比分别为1:1、1:3、1:7、1:19、1:49、1:99时，均能检测出重组阳性质粒，所以本发明的HRM检测方法的灵敏度为1%。[0039]实施例3应用本发明的检测试剂盒检测样本基因突变以实施例2步骤中的检测试剂盒和检测方法，对30例样本进行HRM分析，与重组阳性质粒和重组阴性质粒的熔解曲线对照比较，依此确定样本中的突变类型，并根据HRM分析结果针对每种基因型随机挑选1个样本在生工生物上海进行Sanger测序验证。[0040]HRM分析结果参见表1和图2,数据显示30例样本中JAG2基因SNP位点rs2238286野生型有21例，AG杂合突变型有6例，AG纯合突变型3例。[0041]Sanger测序结果参见图3:其中a为样本编号5的测序结果，b为样本编号9的测序结果，c为样本编号20的测序结果;与本发明方法检测的结果完全一致。[0042]表1应用本发明的方法对样本的分析结果实施例4用于检测JAG2基因SNP位点rs2238286基因型的试剂盒本发明的用于检测JAG2基因SNP位点rs2238286基因型的试剂盒包括以下组分：⑴JAG2rs2238286标准品:重组阴性质粒和重组阳性质粒，按照实施例1中的方法制备；⑵引物:该引物序列为：上游引物:JAG2-F5’-AGGAGCTAGGGGGAGAGAAGAC-3’下游引物:JAG2-R5’-AGGGGTCACCTTGGTGGTTA-3’3含有饱和荧光染料EvaGreen的PCR扩增试剂。[0043]应用该试剂盒检测JAG2基因SNP位点rs2238286基因型的方法与实施例2相同。[0044]最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

权利要求：1.用于检测JAG2基因SNP位点rs2238286基因型的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒包括引物对和PCR检测反应试剂;其中，所述引物对为1或2中的一种：1上游引物:JAG2-F5’-AGGAGCTAGGGGGAGAGAAGAC-3’下游引物:JAG2-R5’-AGGGGTCACCTTGGTGGTTA-3’；2与（1中的互补序列。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述PCR检测反应试剂包括含EvaGreen的Green-2-GoqPCRMastermix〇3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于:所述PCR扩增时的反应体系为：Green-2-GoqPCRMastermix含EvaGreen5μ1引物FIOyMΟ.ΐμΐ引物RIOyMΟ.ΐμΐ模板50ngyl0.5μ1CldH2O4.3μ1总体积lOul。4.根据权利要求1-3任一所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒还包括标准品，所述标准品为重组阴性质粒和重组阳性质粒，所述重组阴性质粒的核苷酸序列为序列表SEQIDNo.1，所述重组阳性质粒的核苷酸序列为序列表中SEQIDNo.2。5.—种检测JAG2基因SNP位点rs2238286基因型的方法，其特征在于:步骤如下：1构建重组阴性质粒和重组阳性质粒:所述重组阴性质粒的核苷酸序列为序列表中SEQIDNo.1，所述重组阳性质粒的核苷酸序列参见序列表中SEQIDNo.2;2构建PCR扩增时的引物对，所述引物对为a或b中的一种：：a、上游引物:JAG2-F5’-AGGAGCTAGGGGGAGAGAAGAC-3’下游引物:JAG2-R5’-AGGGGTCACCTTGGTGGTTA-3’；b、与a中的互补序列；3提取待测样本的外周血基因组DNA，对重组阴性质粒、重组阳性质粒和待测样本的DNA均使用步骤2所述引物，且在同一条件下进行PCR扩增和HRM分析，收集数据；作为优选，所述HRM分析的条件为:94°C90s;60°C30s;83-94°C收集数据，温度上升速率为0.06°Cs;4根据收集数据绘制高分辨率熔解曲线，根据重组阴性质粒、重组阳性质粒的熔解曲线判断待测样本JAG2基因SNP位点rs2238286的基因型：与重组阴性质粒的熔解曲线重合则JAG2基因SNP位点rs2238286的基因型为AA;与重组阳性质粒的熔解曲线重合则JAG2基因SNP位点rs2238286的基因型为GG;在重组阴性质粒和重组阳性质粒之间的则JAG2基因SNP位点rs2238286的基因型为AG。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于:所述PCR扩增时的反应体系为：Green-2-GoqPCRMastermix含EvaGreen5μ1引物FIOyMΟ.ΐμΐ引物RIOyMΟ.ΐμΐ模板50ngyl0.5μ1CldH2O4.3μ1总体积ΐ〇μ1。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于:所述PCR扩增时的反应条件为:94°C预变性3min;94°C变性IOs;60°C退火延伸20s;40个循环。8.权利要求1-4任一所述的试剂盒的使用方法，其特征在于:步骤如下：1提取待测样本的外周血基因组DNA，对重组阴性质粒、重组阳性质粒和待测样本的DNA均使用相同引物，且在同一条件下进行PCR扩增和HRM分析，收集数据；所述HRM分析的条件为：94°C90s;60°C30s;83-94°C收集数据，温度上升速率为0.06〇Cs；2根据收集数据绘制高分辨率熔解曲线，根据重组阴性质粒、重组阳性质粒的熔解曲线判断待测样本JAG2基因SNP位点rs2238286的基因型：与重组阴性质粒的熔解曲线重合则JAG2基因SNP位点rs2238286的基因型为AA;与重组阳性质粒的熔解曲线重合则JAG2基因SNP位点rs2238286的基因型为GG;在重组阴性质粒和重组阳性质粒之间的则JAG2基因SNP位点rs2238286的基因型为AG。9.权利要求1-4任一所述的试剂盒在制备辅助诊断非综合征唇腭裂的试剂中应用。

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