申请/专利权人：黄志玲

申请日：2017-11-13

公开（公告）日：2020-03-13

公开（公告）号：CN107603985B

主分类号：C12N15/12(20060101)

分类号：C12N15/12(20060101);C12Q1/6883(20180101)

优先权：

专利状态码：失效-未缴年费专利权终止

法律状态：2024.06.21#未缴年费专利权终止;2020.03.13#授权;2018.02.13#实质审查的生效;2018.01.19#公开

摘要：本发明提供了秃顶男性生精障碍致病基因JAG1的突变形式，其序列如SEQIDNO:1所示。本发明还提供了秃顶男性生精障碍致病基因JAG1的检测方法，该检测方法是基于JAG1致病基因片段的扩增和其Sanger测序，主要涉及SEQIDNO:2‑SEQIDNO:3序列所示扩增引物对。本发明提供的JAG1致病基因形式尚未被报道，其可以为秃顶男性生精障碍致病机理的解析、致病基因检测以及针对性预防和治疗等提供依据和奠定基础；所构建的JAG1致病基因检测方法具有准确可靠、简便快捷的特点。

主权项：1.秃顶男性生精障碍致病基因JAG1，其特征在于JAG1基因发生了c.20465delTTT的缺失突变，而发生c.20465delTTT缺失突变的JAG1致病基因片段的核苷酸序列如SEQIDNO:1序列所示。

全文数据：秃顶男性生精障碍致病基因JAG1及其检测方法技术领域[0001]本发明涉及基因及其检测方法，特别涉及秃顶男性生精障碍致病基因JAGl及其检测方法。背景技术[0002]在生育年龄的男性中约有5%存在不育问题，其中的40%属于精子质量异常，主要表现为少精症、无精症和精子活力差等生精障碍。男性生育能力依赖于有功能的精子，精子在睾丸内产生和发育的过程是由众多相关基因控制，这些基因发生异常就会影响精子的形成从而造成男性不育。目前认为生精相关基因的突变、插入缺失和遗传多态性是男性生精障碍的重要遗传病因，然而其中大部分生精相关基因尚未得到解析。因此探究男性生精障碍致病基因特征十分有必要，这是揭示男性不育遗传机制、致病基因检测以及针对性预防和治疗的基础。近年来，随着二代测序技术的发展和测序成本的降低，可以实现在基因组层面上对疾病致病基因的研究。然而由于疾病往往存在复杂性，因此必须将二代测序结果和基本体征以及临床信息相结合从特定的疾病亚群入手更好地解析其致病基因特征。[0003]本发明申请人从25例生精障碍患者样本的全外显子组测序结果中发现，有3例患者都出现了JAGl基因的c.20465delTTT突变，而同时此3例患者均为秃顶体征。经进一步验证，本发明申请人首次揭示了基因JAGl也即Jaggedl为秃顶男性生精障碍相关基因并提供了其致病突变形式，在此基础上构建了基于PCR扩增和Sanger测序的突变检测方法。发明内容[0004]本发明提供了秃顶男性生精障碍亚群对应的致病基因，并在此基础上构建了致病基因的检测方法。[0005]本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：本发明的目的之一在于提供秃顶男性生精障碍致病基因JAGl，突变所在片段序列如SEQIDN0:1所示，对应的突变为c.20465delTTT的缺失，发生在Exon4中；所述突变基因形式经验证，为秃顶男性生精障碍致病基因。值得注意的是，SEQIDNO:1仅展现出c.20465delTTT突变所在的片段序列，基因的其余序列详见GeneBank上登录号NG_007496.1的野生型参考基因序列，c.20465delTTT表示的是JAGl基因的20465-20467位点的TTT缺失。[0006]其中，所述秃顶男性生精障碍致病基因的揭示，可以但不限于用于制备秃顶男性生精障碍诊断芯片和试剂盒、构建秃顶男性生精障碍检测方法以及制备秃顶男性生精障碍治疗药物。[0007]本发明的另一目的在于提供秃顶男性生精障碍致病基因突变检测方法，主要是利用SEQIDNO:2-SEQIDNO:3所示引物对扩增JAGl致病基因片段，并对扩增产物进行Sanger测序以判断是否发生c.20465delTTT突变。[0008]其中，SEQIDN0:2-SEQIDN0:3所示引物对扩增的是c.20465delTTT突变所在的基因片段，扩增片段对应于GeneBank上登录号NG_007496.1的野生型参考基因序列的20221-20700,扩增片段长度为480bp。致病基因JAGl片段的扩增引物对SEQIDNO:2-SEQIDN0:3可应用于制备秃顶男性生精障碍诊断芯片和试剂盒以及构建男性生精障碍检测方法中。[0009]本发明提供了JAGl基因引起的秃顶男性生精障碍的c.20465delTTT突变基因形式，以及基于PCR扩增和Sanger测序的致病基因检测方法，这些可以为其致病机理的解析、致病基因检测以及针对性预防和治疗等提供依据和奠定基础。附图说明[0010]图1是JAGl突变基因扩增片段的Sanger测序图谱中突变位点局部，途中箭头指向处为突变位点。此结果对应于实施例1中的Pl号患者，为JAGl基因的c.20465delTTT突变测序局部。[0011]图2是实施例1中Pl号生精障碍患者所在家系的遗传图谱，Pl号患者为图中III。图中正方形表示男性，圆形表示女性;实心表示生精障碍个体，空心表示正常个体，“\”表示秃顶体征；图中“+”表示JAGl基因扩增片段检出c.20465delTTT突变，表示JAGl基因扩增片段未检出c.20465delTTT突变;I和II分别代表第1和2代，数字为成员编号。具体实施方式[0012]以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。[0013]实施例1选择临床检查确诊的25名男性生精障碍患者在其签署了知情同意书的情况下，进行基因检测和分析。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如《分子克隆实验指南KJ.萨姆布鲁克等编著，第三版，科学出版社）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。此外，实施例涉及少精和弱精等生精障碍患者的诊断以及秃顶等的判定依据现有的常规临床和体征标准。[0014]1男性生精障碍患者的基因突变测定取男性患者的肘部静脉血5ml，利用德国Qiagen公司的QIAamp血液基因组提取试剂盒提取待测患者样本基因组DNA，检测合格后将其送华大基因进彳丁全外显子捕获测序。全外显子测序建库采用的是美国Agilent公司的SureSelectHumanAllExonKitVl试剂盒，二代测序仪是美国Illumina公司的Hiseq2500,测序的平均深度超过500X。针对原始测序数据，利用dbSNP数据库，千人基因组数据库和8个HapMap外显子组数据库等数据库过滤无效和多态性信息确定突变位点信息。[0015]2特定体征的男性生精障碍患者亚群界定选择25例男性生精障碍患者中具有相同的特定基因突变的亚群，同时需要满足亚群中患者数不少于3例且能找到共同的体征。对照基因突变结果，结合经询问和临床常规检查检测等得知的患者信息，发现存在秃顶患者亚群共3例编号P1、P2和P3且均含有JAGl基因的c.20465delTTT突变，具体结果如表1所示。P1-P3这3例患者均为成年男性平均年龄为28岁），均肉眼可见秃顶，秃顶面积均大于头顶面积的25%。此3例患者的JAGl基因均发生了c.20465delTTT突变，所在基因片段序列如SEQIDN0:1所示。其余22例非秃顶患者并无JAGl基因的c.20465delTTT突变检出，可以视为对照。[0016]经文献查询和数据库比对发现，秃顶男性生精障碍患者JAGl基因的所述c.20465delTTT缺失突变为本发明首次报道。JAGl是哺乳动物Notchl信号通路中的主要配体的编码基因，JAGl编码蛋白与其受体结合体后，通过激活Notchl信号通路，影响和调控胚胎发育、血管发生、细胞程序性死亡等重要生理过程。有研究表明，JAGl蛋白能够刺激干细胞中的Notch信号，激活毛囊再生。然而，并未有该基因与秃顶男性生精障碍相关的研究报道。[0017]表13例秃顶男性生精障碍患者基因检测及验证结果针对上述c.20465delTTT突变，采用SEQIDN0:2-SEQIDN0:3所示的引物对进行基因片段扩增。扩增体系详见表2,扩增片段对应于GeneBank上登录号NG_007496.1的野生型参考基因序列的20221-20700，扩增片段长度为480bp。[0018]表2扩增体系扩增条件为:94°C预变性3min;30个循环:94°C变性30s，59°C退火30s，72°C延伸45s;72°C终延伸5min。[0019]P1-P3这3例患者JAGl基因扩增产物送上海生工生物工程股份有限公司进行Sanger测序。Sanger测序结果发现均与二代测序结果一致图1，表1。[0020]3家系分析验证致病基因突变由于所述JAGl基因的c.20465delTTT突变未被报道，因此收集P1-P3这3例秃顶男性生精障碍患者家系相关成员血样，PCR扩增JAGl基因片段再进行Sanger测序。以Pl号患者为例，该患者存在JAGl基因的c.20465delTTT突变。如图2所示患者Pl是III，该患者26岁，结婚2年妻子未孕就诊;经精液常规分析显示其连续3次精液检查精子密度每毫升均低于1280万个为少精，其为独子父母健在。此家庭3人经常规体检，发现患者Pl和其父亲均为秃顶，其母亲无明显脱发或秃顶体征。采集患者的父母血液样本提取基因组DNA，参照（2中条件利用SEQIDNO:2-SEQIDNO:3所示引物对扩增JAGl基因片段，Sanger测序显示患者父亲也存在c.20465delTTT突变，而其母亲无该位点突变;经询问得知其父有少精病史，此次进一步检测确诊了。综上结果表明秃顶体征者均为男性且都含有JAGl基因的c.20465delTTT突变，同时出现生精障碍。[0021]表1中的其余2例即P2-P3患者也出现了JAGl基因的c.20465delTTT突变具体详见表1，分析其家系也是秃顶体征者均为男性且都含有JAGl基因的c.20465delTTT突变，同时出现生精障碍。即出现了基因型-表型的家系共分离现象，由此证明了JAGl基因是秃顶男性生精障碍的相关基因，其致病性突变为c.20465delTTT，其所在片段序列如SEQIDNO:1所不。[0022]实施例2另外收集秃顶男性生精障碍患者10例、非秃顶男性生精障碍患者20例以及秃顶但非生精障碍男性10例，将其血样进行基因组提取。对于每例样本，参照实施例1中的体系和方法扩增所述JAGl致病基因片段;扩增产物均进行测序分析。结果只发现了10例秃顶男性生精障碍患者均出现了JAGl基因的c.20465delTTT突变，相关数据如表3所示。[0023]表310例秃顶男性生精障碍患者JAGl基因片段测序结果10例秃顶生精障碍患者均出现了JAGl基因的c.20465delTTT突变，而在20例非秃顶男性生精障碍患者和10例秃顶但非生精障碍男性均不存在JAGl基因的c.20465delTTT突变，从而从正反两方面再次验证了本发明提供的JAGl基因的c.20465delTTT突变形式为秃顶男性生精障碍致病基因，以及本发明提供的检测方法具有良好的可靠性和准确性。[0024]基于本发明新鉴定的JAGl基因的c.20465delTTT致病突变形式，本发明申请人将突变所在的扩增子进行纯化，将其克隆到商业化质粒等载体中，之后将其导入大肠杆菌等宿主菌中，菌液存于终浓度20%VV甘油的冻存管中，置于-80°C冰箱中长期保存。另一方面，由于本发明对于致病基因序列的公布，可以采用定点突变的方式由野生型基因制备得至IJ，或通过序列合成的方式获取。[0025]虽然本发明是通过优选的具体实施例进行说明，但是对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

权利要求：1.秃顶男性生精障碍致病基因JAG1，其特征在于JAGl基因发生了c.20465delTTT的缺失突变，而发生c.20465delTTT缺失突变的JAGl致病基因片段的核苷酸序列如SEQIDN0:1序列所示。2.根据权利要求1所述的秃顶男性生精障碍致病基因JAGl，其特征在于所述致病基因JAGl在制备秃顶男性生精障碍诊断芯片和试剂盒、构建秃顶男性生精障碍检测方法以及制备秃顶男性生精障碍治疗药物中的应用。3.根据权利要求1所述的秃顶男性生精障碍致病基因JAGl，其特征在于秃顶男性生精障碍致病基因JAGl检测方法的主要步骤为：1利用SEQIDN0:2-SEQID勵:3序列所示引物对扩增可发生：.204651611'1'1'突变的JAGl致病基因片段；2对（1中扩增产物进行Sanger测序判断是否发生c.20465delTTT突变。4.根据权利要求1所述的秃顶男性生精障碍致病基因JAGl检测方法，其特征在于所述致病基因JAGl片段的扩增引物对SEQIDN0:2-SEQID冊:3在制备3.20465^11'1'1'突变相关的秃顶男性生精障碍诊断芯片和试剂盒以及构建秃顶男性生精障碍检测方法中的应用。

百度查询： 黄志玲 秃顶男性生精障碍致病基因JAG1及其检测方法

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