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申请/专利权人：中国烟草总公司郑州烟草研究院

摘要：本发明属于烟草基因工程技术领域，具体涉及一个烟草氯离子通道蛋白NtCLC2及其应用专利申请。该基因CDS序列包括2343bp碱基，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示；其中第1426位‑1738位核苷酸为特异性核酸片段。烟草氯离子通道蛋白NtCLC2是烟草氯离子代谢的关键蛋白，通过病毒诱导的基因沉默（VIGS）的技术，抑制NtCLC2基因表达后，转基因沉默植株中氯离子含量明显降低。基于此，可为培育低氯含量烟草新品种奠定良好基础，同时也为烟叶质量的稳定和卷烟质量改善提供了根本性的技术支撑。

主权项：1.烟草氯离子通道蛋白NtCLC2的编码基因NtCLC2基因，其特征在于，该基因CDS序列包括2343bp碱基，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示；其中第1426位‑1738位核苷酸为特异性核酸片段。

全文数据：一个烟草氯离子通道蛋白NtCLG2及其应用技术领域[0001]本发明属于烟草基因工程技术领域，具体涉及一个烟草氯离子通道蛋白NtCLC2及其应用专利申请。背景技术[0002]针对烟草的已有研究普遍认为，烟叶中的氯离子含量以0.3~0.8为宜，在含量达到1%时会影响阴燃持火性，进一步高于1%时会出现黑灰熄火现象;另一方面，烟叶中氯离子含量过高时会造成淀粉积累多，叶片肥厚而脆，吸湿性大，使得存放时颜色易变深，产生不良气味。总之，烟叶中氯离子含量对于烟叶质量具有较为重要的直接影响。[0003]基于烟叶中氯离子含量对烟草品质的直接影响和其重要性，部分研宄人员对全国各地烟叶中氯离子含量进行了检测统计，结果表明（中国烟草总公司郑州烟草研宂院，《中国烟叶质量白皮书（2015年）》）：河南2011年〜2015年烤烟烟叶化学成分中氯离子含量0•53%-0.65%远高于全国均值0•26%-0•30%。此外，根据上烟集团对豫中烟区2012-2015年氯含量测定的平均值，尤其是2014年度数据（下部叶2.21%、中部叶2.09%及上部叶2.03%，豫中烟区近几年氯离子含量都远远高于全国水平。这些统计数据表明，部分地区烟叶质量不均一性、尤其是烟叶中氯离子含量的不均一性甚至偏高特点，己成为制约浓香型烟叶品质提高的瓶颈之一。[0004]为解决烟叶氯离子含量偏高的问题，传统改善方式多是从栽培技术入手，通过优化田间管理措施、完善调制发酵技术来稳定和提升烟叶品质。但总体而言，这些措施并未从根本上改变这些烟叶质量偏低、工业实用性不强的局面。因而使得相关改进措施缺乏较好实用性。[0005]随着基因组学尤其是基因编辑技术的快速发展，使得人们对于烟叶中氯离子积累与相关基因之间的关系认识越来越深入。基于已有研究已经知晓的是:对于CLCChlorideChannel蛋白家族，拟南芥中有7个成员，研宄表明AtCLCa在驱使硝酸盐进入液泡的过程中起到关键作用，而AtCLCb就没有这种功能；其他的AtCLC分布在其他细胞区间，AtCLCd和AtCLCf可能在转运高尔基囊泡网络中起到酸化作用;AtCLCe可能参与类囊体膜的阴离子渗透性;AtCLCg与AtCLCc功能一致，参与植物盐胁迫。2010年]〇8316]：等人在研宄拟南芥^^时发现（TheArabidopsisvacuolaraniontransporter,AtCLCc，isinvolvedintheregulationofstomatalmovementsandcontributestosalttolerance,PlantJournal，2010,64⑷：563-576，AtCLCc定位于叶片的保卫细胞，突变株对盐敏感。但总体而言，由于CLC家族蛋白功能的多样化，以及不同物种中CLC家族蛋白功能并不完全一致，因此，仅就烟草品种改良而言，针对烟草中CLC家族蛋白的功能进行深入研宄可为烟草品种改良、甚至可为其他植物改良奠定良好理论基础和应用基础。发明内容[0006]本发明目的在于提供一个烟草氯离子通道蛋白NtCLC2chloridechannel，CLC，该基因所编码的烟草氯离子通道蛋NtCLC2与^+的吸收转运相关，基于这一功能，可为低氯离子含量的烟草新品种奠定基础。[0007]本申请所采取的技术方案详述如下。[0008]烟草氯离子通道蛋白NtCLC2的编码基因基因，该基因来源于烟草OVicotianatafoacun，其CDS序列包括2343bp碱基，其碱基序列如SEQIDN0.1所不；其中第1426位-1738位核苷酸为特异性核酸片段。[0009]PCR扩增获得所述vtac基因的方法，具体可参考如下：1提取烟草样品的总RNA，并反转录为CDNA备用；2设计扩增引物序列如下：F:5，-CGCGAGCTCGGTACCATGGMGATCMGGTGAT-3’，R:5’_GCTCACCATGGATCCCTTGTGATGGACCMAT_3’；以步骤⑴中所制备cDNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增即可。[0010]烟草氯离子通道蛋白NtCLC2蛋白，为一种离子通道蛋白，该蛋白与氯离子转运相关，包括480个氨基酸，其氨基酸序列如SEQIDN0.2所示。[0011]所述烟草氯离子通道蛋白NtCLC2在烟草中的应用，用于转运氯离子。[0012]所述烟草氯离子通道蛋白NtCLC2的编码基因财CLC2基因在烟草中的应用，将该基因沉默后，植物体内氯离子含量明显下降。[0013]用于沉默烟草氯离子通道蛋白NtCLC2的编码基因基因的瞬时沉默VIGS载体，其构建方法为：利用病毒诱导的基因沉默（VIGS技术，以所述烟草氯离子通道蛋白NtCLC2的编码基因基因的特异性核苷酸片段作为引导序列，将该特异性核酸片段连接到瞬时表达载体TRV上，转化大肠杆菌DH5a后，进一步经筛选、鉴定，构建获得瞬时沉默VIGS载体:TRV-MCLC2。[0014]所述用于沉默烟草氯离子通道蛋白NtCLC2的编码基因价CLC2基因的瞬时沉默VIGS载体在烟草中的应用，利用转基因技术，将该VIGS载体转化烟草植株后，用于沉默财基因，使得烟草氯离子通道蛋白NtCLC2蛋白基因表达量明显降低甚至无法表达，最终降低植物体中氯离子含量。[0015]一种培育低氯植物品种的方法，利用转基因技术，将所述用于沉默烟草氯离子通道蛋白NtCLC2的编码基因iVtaa基因的瞬时沉默VIGS载体转化植物体，筛选、鉴定获得瞬时沉默植株；或者利用RNAi干扰的方法，构建基因沉默载体，转化普通烟草，经过筛选、鉴定即可获得转基因植物新品种，转基因植物新品种中咐CLC2基因的表达受到限制;所述待转化植物体为普通栽培烟草。[0016]本发明中的烟草氯离子通道蛋白NtCLC2是烟草氯离子代谢的关键蛋白，通过real-timePCR发现该jVtCLC2基因在烟草各个组织中都表达，且在烟草茎部、叶芽等组织表达相对较高。为进一步确认该蛋白功能，通过病毒诱导的基因沉默VIGS的技术，构建了沉默iVtCLC基因的VIGS载体，转化后成功获得了抑制在本氏烟草中表达的转基因沉默植株。检测结果表明，相对对照植株，转基因沉默植株中氯离子含量明显降低，降低了至少35%，即：所获得的转基因沉默植株拥有氯离子含量相对对照植株明显降低的特异表型，换言之，沉默A^CLC2基因后可以显著降低植物体内的氯离子含量。[0017]结合现有基因工程技术可以看出，利用基因沉默技术通过敲除或者沉默7vtac基因后，可以明显降低植物体内的氯离子含量，基于此，可为培育低氯含量烟草新品种奠定良好基础，同时也为烟叶质量的稳定和卷烟质量改善提供了根本性的技术支撑。附图说明[0018]图1为不同组织器官中iVt;CLC2的相对表达量；图2为沉默植株中基因的相对表达量；图3为烘干后各处理组烟叶中的氯离子含量。具体实施方式[0019]下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中所涉及部分生物材料、实验试剂、实验仪器等基本情况简要介绍如下。[0020]生物材料：烟草材料:本氏烟草OVicotianabefithaniafia，一种商品化烟草品种；干扰载体:TRV，购自中国质粒载体菌细胞基因保藏中心；基因测序及引物合成，由上海生工提供完成；实验试剂：LATaq酶、PstI限制性内切酶，质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒等，购自Takara公司，In-Fusion—步法克隆试剂盒，购自clontech公司；RNA提取试剂盒，购自于GeneAnswer公司；反转录试剂盒、RT-PCR试剂盒，购自Roche公司；蛋白胨、酵母提取物等，购自〇x〇id公司；部分试剂配方及配制方法简要说明如下：1LB液体培养基（1L:10g细菌蛋白胨bacteriologicalpeptone，10g氯化钠NaCl，5g酵母抽提物yeastextract，高温高压灭菌；2YEB液体培养基（1L:5g牛肉浸嘗（beefextract，5g细菌蛋白膝bacteriologicalpeptone，5g蔗糖（sucrose，1g酵母抽提物（yeastextract,2ml1M硫酸镁MgS04，高温高压灭菌；31M2-N-吗啉）乙磺酸MES储备液:ddH20溶解MES，过滤灭菌，-2TC储存备用；42〇0mM乙酰丁香酮Acetosyringone储备液:二甲基亚砜DSM0溶解乙酰丁香酮，_2〇°C储存备用；5MMA1L:20g庶糖（sucrose，5gMSsaltsDuchefaBiochemie，1.95gMES，1ml乙酰丁香酮（200mM，），pH=5.6;实验仪器：PCR仪Tgradient，Biometra公司产品，实时定量PCR仪LightCyc1er96，Roche公司产品。[0021]实施例1本实施例主要就烟草氯离子通道蛋白基因的获得过程，简要介绍如下。[0022]以栽培种烟草叶片为样品，利用RNA提取试剂盒提取烟草叶片总RNa，反转录为cDNA备用；通过同源比对的方法，参考拟南芥tCLC2基因的序列及已知烟草部分基因序列，设计扩增引物序列如下：F:5，_CGCGAGCTCGGTACCATGGAAGATCMGGTGAT-3,，R:5，_GCTCACCATGGATCCCTTGTGATGGACCAAAT-3,；以上述所制备cDNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增。[0023]PCR反应体系为：上游引物1此，下游引物lyL，cDNAlyL,10Xbuffer5yL，dNTP6yL,EazyTaq酶lyL，加ddH2〇至50yL。[0024]PCR反应程序:94°C预变性5min;94°C变性30s，55°C退火45s，72°C延伸lmin，35个循环;72°C延伸lOmin。[0025]PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，回收目的条带。采用In-Fusion方法将上述PCR产物与植物表达载体pFF19连接，转化大肠杆菌感受态DH5a，37°C培养过夜。[0026]对扩增产物进行提纯后测序，获得了烟草氯离子通道蛋白NtCLC2的编码基因基因，共包括2343bp个碱基，分析表明其中第1426位-1738位核苷酸为特异性核酸片段，碱基序列如SEQIDNO.1所示，具体如下：ATGGAAGATCAAGGTGATATAGAGAATGAAGGAGGAGGAATTGGGGTGATGATAATGGAGAATGGCAAAGATTTGGAGAGGAATATTTCAGCGGTTTCTGAGAGTGGTGTTAGACAGCCATTGCTTAGTTCTAAAAGCAGAGTCAATAATACCTCACAAATTGCTATTATAGGAGCCAATGTTTGCCCCATTGAAAGTCTTGATTATGAGATTATTGAAAATGACCTTTTCAAGCAAGATTGGAGATCTAGGAAAAAAGTCCAGATATTTCAATATATATTCCTAAAGTGGACACTTGTGCTTCTTATTGGATTGAGTGTAGGGCTTGTTGGTTTCTTTTTAAACATAGCAGTGGAAAATATTGCTGGCTTCAAGCTTCTGCTCATTAGTGACTTAATGCTTCAGGACAAGTATTTCCGTGGATTTGCTGCTTATGCATGTTGCAATTTGGTTCTTGCGACTTGTGCTGGAATCCTATGTGCATTTATTGCACCAGCAGCTGCAGGGTCAGGAATACCTGAAGTGAAAGCATATCTCAATGGTATCGATGCTCATTCCATTTTAGCTCCAAGTACTTTATTTGTGAAGATATTTGGTTCTGCTTTGGGTGTTTCTGCTGGATTTGTTGTTGGCAAGGAAGGACCCATGGTCCATACTGGCGCTTGCATAGCAAACTTGCTTGGACAGGGCGGCTCCCGCAAGTATCATCTGACTTGGAAGTGGCTGAAGTATTTCAAAAATGACCGTGACCGTAGAGATTTGATCACTTGTGGTGCTGCAGCTGGTGTTGCAGCTGCTTTCCGAGCCCCAGTCGGTGGTGTTCTTTTTGCTCTTGAAGAAGTAGCCTCATGGTGGCGAAGTGCTCTTCTTTGGAGGACCTTCTTCTCGACTGCTGTAGTAGCTATGGTGCTCAGATCTTTCATTGTATTCTGTCGGAGCGGGAAATGTGGACTATTTGGTCAAGGAGGTTTGATAATGTATGATGTGAATTCAGGAGCACCTAATTATAACACTATAGATGTACTGGCAGTGTTGTTAATTGGAGTTCTTGGAGGCCTTCTCGGAAGCCTTTATAATTATCTAGTGGACAAGGTCCTCCGGACTTACAGCATCATTAATGAGAGGGGTCCTGCTTTCAAAGTCTTGCTCGTAATGACCATTTCAATCCTGAGTTCTCTTTGCTCGTATGGTCTACCGTGGTTTGCAACTTGCACACCATGTCCTGTAGGCTTGGAGGACAAGTGCCCTACTATAGGTCGCTCTGGAAACTATAAGAATTTCCAGTGTCCAGCGGGGCATTACAATGATCTAGCCTCCCTGTTTATGAATACCAATGATGACGCCATCCGCAATTTGTTTAGCTCAGATAATTCCAGCGAATTTCACCTCTCTTCGCTTTTTGTCTTCTTTGCTGGGGTATATTGCCTTGGCGTCGTTACTTATGGAATTGCTATTCCCTCTGGGCTATTCATTCCCGTCATACTTGCCGGTGCCTCCTATGGACGTTTTGTTGGGACTGTCTTGGGTTCGATATCCAATCTTAATAACGGCCTCTTTGCTCTCCTTGGTGCTGCTTCCTTCCTCGGGGGTACTATGAGGATGACGGTATCCATCTGTGTCATACTACTTGAGCTCACCGATGACCTGCTAATGCTTCCATTGGTGATGCTTGTGCTCCTTATTTCAAAGACTGTGGCTGATTGTTTTAACCATGGTGTCTATGACCAGATTGTGAAAATGAAAGGCTTGCCTTATTTGGAAGCACACGCCGAACCATACATGAGGCAATTAGTTGCAGGAGATGTTTGTTCAGGGCCTTTAATTACATTTTCAGGTGTTGAGAAGGTAGGGAACATAATACATGCTTTGAAGTTTACTAGACACAATGGGTTTCCCGTGATTGATGCACCGCCATTCTCAGACGCGCCAGAGTTCTGTGGACTTGCTTTAAGGTCACACCTACTTGTTTTGCTCAAAGCAAAGAAATTCACGAAACTAAGTGTATTGAGCGGCTCCAGTATTTTGAGGAGTTTTCATGCGTTTGATTTCGCTAAGCCAGGATCGGGGAAGGGGCCTAAGCTCGAGGATTTGTCCTTCACCGATGAGGAGATGGAAATGTATGTAGATCTCCATCCTGTCACAAATACATCTCCATACACAGTAGTGGAAACCATGTCTCTGGCCAAAGCTGCAATCCTTTTTCGACAACTTGGTCTGAGACACTTGTGTGTTGTACCAAAAAAGACTACCGGGAGGGATCCAATAGTTGGAATTTTGACAAGGCATGACTTTATGCCAGAACATATAAAGGGACTGTACCCACATTTGGTCCATCACAAGTAGo[0027]对编码基因基因进行分析、翻译后，可知烟草氯离子通道蛋白NtCLC2的氨基酸序列，该蛋白共包括480个氨基酸，氨基酸序列如SEQIDN0.2所示，具体如下：AMVLRSFIVFCRSGKCGLFGQGGLIMYDVNSGAPNYNTIDVLAVLLIGVLGGLLGSLYNYLVDKVLRTYSIINERGPAFKVLLVMTISILSSLCSYGLPWFATCTPCPVGLEDKCPTIGRSGNYKNFQCPAGHYNDLASLFMNTNDDAIRNLFSSDNSSEFHLSSLFVFFAGVYCLGVVTYGIAIPSGLFIPVILAGASYGRFVGTVLGSISNLNNGLFALLGAASFLGGTMRMTVSICVILLELTDDLLMLPLVMLVLLISKTVADCFNHGVYDQIVKMKGLPYLEAHAEPYMRQLVAGDVCSGPLITFSGVEKVGNIIHALKFTRHNGFPVIDAPPFSDAPEFCGLALRSHLLVLLKAKKFTKLSVLSGSSILRSFHAFDFAKPGSGKGPKLEDLSFTDEEMEMYVDLHPVTNTSPYTVVETMSLAKAAILFRQLGLRHLCVVPKKTTGRDPIVGILTRHDFMPEHIKGLYPHLVHHK〇[0028]为了进一步了解JVtCLC2基因在不同组织中的表达特异性，利用real-timePCR技术，分别以栽培烟种子、成熟期烟草叶片、茎、根、叶芽、雄蕊、雌蕊和花萼等器官为样品，对iVtaC2基因在不同组织中的表达情况进行了检测。结果如图1所示。[0029]分析可以看出WVtCLC2基因在烟草的各个组织中都有表达，且在烟草茎部、花花芽、雌蕊、雄蕊、花萼等组织中的表达量最高，这也表明该基因与植物在初期的营养吸收及后期的生长繁殖阶段高度相关。[0030]实施例2为确定VtCLC2基因在烟草中的功能，选择iVtCLC2基因中特异核酸片段序列表SEQIDNO.1的第142e位-1738位核苷酸序列作为引导序列，构建了沉默基因用的瞬时沉默用VIGS载体，并进一步转化烟草植株构建了转基因植株，相关实验过程简要介绍如下。[0031]—构建瞬时沉默用VIGS载体首先，设计PCR扩增用引物序列如下：NtCLC2~F：5，-CGACGACAAGACCCTCTTGGCGTCGTTACTTAT-3,,NtCLC2~R：5,-GAGGAGAAGAGCCCTTTCACAATCTGGTCATAG-3,；以上述引物序列进行PCR扩增扩增长度:312bp获得VIGS的引导序列；其次，利用In-Fusion的法，将上述扩增的引导序列与TRV载体5TC连接15min连接，筛选、测序验证构建获得连接正确的TRV-MCLC2载体。[0032]二转化农杆菌采用冻融法，将TRV-VtCLC2载体转化农杆菌GVMOl后，挑取阳性单克隆菌落，液体培养后，利用菌液PCR方法验证确保目的片段转化正确，并将转化正确的菌液保存备用。[0033]需要说明的是，作为对照，同样操作方式条件下，分别将TRV1、TRV2、TRV2_PDS阳性对照转化了农杆菌GV3101并制备了对照用转染菌液。[0034]三制备转染液将步骤三）中所制备的含有TRV1、TRV2、TRV2-PDS阳性对照）的农杆菌单菌落分别接入¥£851111培养基中（卡那霉素，50吨111〇,28°：、250以111111过夜振荡培养约48h;转接至50mL的YEB中，28°C过夜振荡培养；4000rmin离心8min收集农杆菌到50mL离心管中，并用含有10mmolL2-N-吗琳基乙横酸MES、20ulL乙酰丁香酮Acetosyringone，As和10mmolL的MgCl2的混合溶液将上述菌液的0D值调至1.0左右。[0035]在含有TRV2、TRV2-PZS、TRV-iVtCLC2的农杆菌的MMA悬浮液中等体积加入含TRV1农杆菌的MMA悬浮液混匀，室温放置3〜6h作为转染液。[0036]四）制备转化体并进行转化将烟草种子本氏烟草）播种于育苗钵中育苗，待发芽后两周进行分苗，种于塑料钵10cmX10cm中，于22°C、16h光8h暗条件下进行日常肥水管理等，生长4〜5w，选取长势一致12盆烟草幼苗作为转化体；转化接种时挑选长势一致的约4〜5片叶子，用lmL无针头无菌注射器通过压滤法把含有不同TRV重组质粒的农杆菌悬浮液从叶片背面压入全部展开的叶片中，使菌液充满整个叶片，于22°C、75%湿度条件下进行培养；其中，含TRV2-PDS阳性对照的注射植株接种4盆，其余含TRV2空载体、含TRV2-M;CLC2的注射植株各接种4盆。[0037]接种6周后，检测各处理组植株中妣基因表达量采用real-timePCR技术）及氯离子的含量。[0038]氯离子含量的检测，具体参考如下方法进行：每个处理组植株取3〜4片叶子，用锡箔纸包裹后放入烘箱90°C烘干过夜；将烘千的样品用研磨仪打碎，称取0.05g烟叶精确至0•〇〇〇lg，加入15ml、5%的乙酸溶液，置于恒温振荡器3TC摇床），恒温震荡30min;滤纸过滤后上连续流动分析仪测定氯离子含量。[0039]对基因表达量检测结果如图2所示，从图2可以看出，财CLC2基因表达量较低，表明mac基因成功被沉默，转基因体构建成功。[0040]对植株体内氯离子含量检测结果如图3所示。从图3中可以看出，基因沉默植株中氯离子含量约是对照植株氯离子含量的63%;即，基因沉默后，植株中氯离子含量下降了37%左右。[0041]基于上述数据结果可以看出，AftCLC2基因与其编码的烟草氯离子通道蛋白NtCLC2与氯离子转运高度相关，利用这一成果，可为低氯含量烟草新品种培育奠定良好基础。

权利要求：1.烟草氯离子通道蛋白NtCLC2的编码基因咐CLC2基因，其特征在于，该基因CDS序列包括2343bp碱基，其碱基序列如SEQIDN0.1所示;其中第1426位-1738位核苷酸为特异性核酸片段。2.—种PCR扩增获得权利要求1所述基因的方法，其特征在于，具体步骤为：1提取烟草样品的总RNA，并反转录为cDNA备用；2设计扩增引物序列如下：F:5’-CGCGAGCTCGGTACCATGGAAGATCAAGGTGAT-3’，R:5’-GCTCACCATGGATCCCTTGTGATGGACCAAAT-3’；以步骤⑴中所制备cDNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增。3.权利要求1所逾VtCLC2基因所编码的烟草氯离子通道蛋白NtCLC2蛋白，其特征在于，该蛋白为一种离子通道蛋白，与氯离子转运相关，包括480个氨基酸，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。4.权利要求2所述烟草氯离子通道蛋白NtCLC2在烟草中的应用，其特征在于，用于转运氯离子。5.权利要求1所述烟草氯离子通道蛋白NtCLC2的编码基因咐CLC2基因在烟草中的应用，其特征在于，将该基因沉默后，植物体内氯离子含量明显下降。6.利用权利要求1所述烟草氯离子通道蛋白NtCLC2的编码基因jVtCLCP基因所构建的用于沉默基因的瞬时沉默VIGS载体，其特征在于，其构建方法为:利用病毒诱导的基因沉默技术，以所述烟草氯离子通道蛋白NtCLC2的编码基因财CLC2基因的特异性核苷酸片段作为引导序列，将该特异性核酸片段连接到瞬时表达载体TRV上，转化后，进一步经筛选、鉴定，构建获得瞬时沉默VIGS载体:TRV-MCLC2。7.权利要求6所述用于沉默iVtCLC2基因的瞬时沉默VIGS载体在烟草中的应用，其特征在于，利用转基因技术，将该VIGS载体转化烟草植株后，用于沉默A?tCLC2基因，使得烟草氯离子通道蛋白NtCLC2蛋白表达量明显降低甚至无法表达，最终降低植物体中氯离子含量。

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