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申请/专利权人：浙江大学;浙江全植生物科技有限公司

摘要：本发明公开了一种植物乳杆菌Lactobacillus plantarumZJUF HN9及其应用，属于生物技术领域。植物乳杆菌ZJUF HN9分离自传统发酵剂酸面团，保藏号为CCTCC NO:M 2017341。本发明提供的植物乳杆菌ZJUF HN9具有耐受高含量胆盐的能力，有利于其在肠道中存活和繁殖；在胃肠道环境中具有较高生存率、较强的胃肠粘附力，能显著抑制胃肠道致病菌的繁殖，尤其是鼠伤寒沙门氏菌；此外，该植物乳杆菌具有制备发酵乳的潜力。

主权项：1.一种植物乳杆菌Lactobacillus plantarumZJUF HN9，该植物乳杆菌的保藏号为CCTCC NO:M 2017341。

全文数据：植物乳杆菌ZJUFHN9及其应用技术领域本发明涉及生物技术领域，具体涉及植物乳杆菌LactobacillusplantarumZJUFHN9及其应用。背景技术植物乳杆菌是一种常见的乳酸菌，广泛存在于发酵食品中，如酸面团、泡菜、酸乳、葡萄酒等，因此其在食品领域应用广泛。植物乳杆菌与其他益生乳杆菌一样，具有降低胆固醇、调节免疫以及维持健康肠道菌群等功能Seddiketal.,2017。益生菌发挥益生作用的前提是顺利通过胃的酸性环境以及十二指肠高胆盐环境，以活菌的状态到达小肠和大肠，进而发挥微生态调整的功能Hood&Zottola,1988。而肠道是乳酸菌最终定值部位，正常生理情况下胆盐的残留量约为0.05％-2.0％Ruizetal.,2013。因此在益生菌筛选工作中，对胆盐的耐受是益生菌必备的生理特征。胆盐是肝细胞分泌的胆汁酸分别与钠或钾结合形成的盐类，如甘氨胆酸钠、牛磺胆酸钠等。胆盐是胆汁的主要成分之一，在人体中可以促进脂肪的消化和吸收、促进胆固醇代谢、激活胰酶等。胆盐是一种阴离子表面活性剂，对细胞膜的磷脂双分子层有很强的破坏作用，改变细胞的通透性，从而造成细胞损害或者死亡Begleyetal.,2005。现有研究表明，从生境中筛选得到的野生型乳酸菌，绝大多数对胆盐的耐受性能较差，从胃肠道或阴道中筛选得到的乳酸菌的耐受能力相对较好。从传统发酵食品中筛选得到的对胆盐耐受能力较好的，有发酵乳杆菌Baoetal.,2010、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌Guoetal.,2009，耐受较高浓度胆盐的植物乳杆菌仍未见报道。发明内容本发明的目的在于提供一种植物乳杆菌LactobacillusplantarumZJUFHN9，该植物乳杆菌具有优异的耐受高含量胆盐的能力，其耐受胆盐浓度达到0.3％-1.8％，可以确保其在肠道中的生存、繁殖，为提高益生菌胆盐耐受性提供研究基础。本发明从北方做馒头用的传统发酵剂酸面团中分离筛选得到一菌株HN9，经16SrRNA基因比对，鉴定该菌株为植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌ZJUFHN9LactobacillusplantarumZJUFHN9。植物乳杆菌ZJUFHN9的16SrRNA的碱基序列如SEQIDNO.1所示。将植物乳杆菌ZJUFHN9于2017年6月16日保藏于中国典型培养物保藏中心地址：中国，武汉，武汉大学，保藏号为：CCTCCNO:M2017341。体外实验证明，植物乳杆菌ZJUFHN9具有耐受胃肠道转运液的能力，在模拟人工胃肠道环境中具有很高的生存率，而且能耐受较高浓度1.8％的胆盐，有利于其在胃肠道中存活或繁殖。植物乳杆菌ZJUFHN9自凝率24小时达到84％，能够选择性粘附革兰氏阴性菌特指大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌，其在肠道中与致病菌凝集，并顺利排出体外，有利于肠道健康。植物乳杆菌ZJUFHN9能够显著抑制胃肠道致病菌的繁殖，如大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌。因此，植物乳杆菌ZJUFHN9可用于预防或调节胃肠道菌群失衡。本发明的另一个目的是提供植物乳杆菌ZJUFHN9在制备抑制胃肠道致病菌的药物或食品中的应用。作为优选，所述胃肠道致病菌为大肠杆菌或鼠伤寒沙门氏菌。作为优选，所述药物由植物乳杆菌ZJUFHN9菌剂与在药学上可接受的载体组成。所述植物乳杆菌ZJUFHN9菌剂为将含有所述植物乳杆菌ZJUFHN9的菌液通过冷冻干燥制得的粉剂，其中含有＞1011CFUg的活性植物乳杆菌ZJUFHN9。作为优选，所述药物的剂型为颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液剂型。本发明的另一个目的是提供植物乳杆菌ZJUFHN9在生产发酵乳制品中的应用。所述植物乳杆菌ZJUFHN9具有发酵乳的潜力，作为发酵剂添加到脱脂乳中，24h发酵过程中，可以降低pH值到4.3；增加TTA值到108；显著增加发酵乳中蛋白水解程度，丝氨酸含量可达到22mgmL；发酵过程和4℃保存过程中能保持较高活菌率。优选地，植物乳杆菌ZJUFHN9按照1.5-2×107cfumL添加到经灭菌处理的脱脂乳培养基脱脂乳11.5％，葡萄糖0.75％，蔗糖5％wv中，37℃条件下发酵24h。本发明具备的有益效果：本发明提供的植物乳杆菌ZJUFHN9具有耐受高含量胆盐的能力，有利于其在胃肠道中存活和繁殖；在胃肠道环境中具有较高生存率、较强的胃肠粘附力，能显著抑制胃肠道致病菌的繁殖，尤其是鼠伤寒沙门氏菌；此外，该植物乳杆菌具有制备发酵乳的潜力。附图说明图1为LactobacillusplantarumZJUFHN9在模拟人工胃液中的耐受。图2为LactobacillusplantarumZJUFHN9在模拟人工胃肠液转运中的耐受。图3为LactobacillusplantarumZJUFHN9自凝集特性。图4为LactobacillusplantarumZJUFHN9发酵乳24小时内pH变化。图5为LactobacillusplantarumZJUFHN9发酵乳4℃放置2周内pH变化。图6为LactobacillusplantarumZJUFHN9发酵乳24小时内TTA变化。图7为LactobacillusplantarumZJUFHN9发酵乳4℃放置2周内TTA变化。图8为LactobacillusplantarumZJUFHN9发酵乳24小时内丝氨酸浓度变化情况。图9为LactobacillusplantarumZJUFHN9发酵乳4℃放置2周内丝氨酸浓度变化情况。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。实施例11、菌株的筛选及分离材料：酸面团，北方做馒头用的传统发酵剂，本发明采用来自河南的样品。称取5g酸面团加入到45mL0.85％的灭菌生理盐水中，振荡制成悬液，进行系列梯度稀释，稀释后取10-5、10-6、10-7三个梯度涂布于MRS培养基上，每个梯度做三个平行。将涂布后的平板放入37℃厌氧培养箱中培养24-48h。挑选差异明显的菌落进行MRS培养基上划线分离，将平板放入37℃厌氧培养箱中培养24-48h。连续划线3-5次后，取一滴现配的5％的过氧化氢滴于载玻片上，挑取固体培养基上单菌落接入5％的过氧化氢液滴中并混匀，产生气泡为过氧化氢酶试验阳性，未产生气泡为过氧化氢酶试验阴性，过氧化氢酶试验阴性菌株为疑似益生菌株。将筛选得到的疑似益生菌株分别以1％接种量接入MRS-THIO液体培养基MRS中添加0.2％的巯基乙酸钠和含0.3％wv的猪胆盐的MRS-THIO培养基中上述处理放置在37℃厌氧培养箱中培养24h，取样在620nm下测定吸光值，计算24h的OD值差值，检测菌株的生长能力。将上述筛选得到的疑似益生菌株以1％接种量接种到pH3.0的MRS培养基中，37℃厌氧培养箱中培养24h，取样在600nm下测定吸光值，计算24h的OD值差值，检测菌株的生长能力，筛选得到了HN9。2、菌株的鉴定将HN9进行革兰氏染色，并进行了16SrRNA基因菌种鉴定，此鉴定送样上海派森诺生物有限公司进行，经过16SrRNA基因比对，HN9为一株植物乳杆菌，命名为LactobacillusplantarumZJUFHN9。将植物乳杆菌ZJUFHN9于2017年6月16日保藏于中国典型培养物保藏中心地址：中国，武汉，武汉大学，保藏号为：CCTCCNO:M2017341。3、最高胆盐浓度耐受性实验配制含不同胆盐浓度0.3％、0.4％、0.6％、0.8％、1.0％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％的MRS液体培养基，以不加胆盐的培养基作为对照，按1％的接种量接入培养基中，37℃厌氧培养24h，在0h和24h时测定620nm下测定吸光值，计算差值。培养基调整pH值为7.0。OD值差值0说明在此胆盐浓度下LactobacillusplantarumZJUFHN9可以生长，下表1所示，在0.3-1.8％的胆盐浓度下，LactobacillusplantarumZJUFHN9均可以生长，说明其可以耐受0.3-1.8％的胆盐。表1LactobacillusplantarumZJUFHN9对不同胆盐耐受情况与未添加胆盐的培养基比较，HN9在0.3％的胆盐的培养基中的生长状况与未添加胆盐的培养基的生长状况基本相同相对百分比均在96％以上，说明此菌株HN9在0.3％胆盐浓度下可以正常生长。人体胃肠道中肠液胆盐浓度一般在0.3％浮动，此性能可以较好得维持菌株在肠液中的活力。虽然随着浓度的增加，HN9的OD值增加低于未添加胆盐的，但OD值24h的增加也都在1.000以上，说明HN9具有良好的生长能力。除了胆盐浓度为0.6％时，在其余浓度下的HN9生长的相对百分比均在85％以上，确定了菌株HN9在较高浓度胆盐下的耐受能力，显示了良好的生长能力。4、模拟人工胃肠液耐受性人工胃液：NaCl0.2g100mL，胃蛋白酶pepsin0.35g100mL，用1molLHCl调整pH为2.0，2.5，3.0，4.0，过滤除菌备用0.22um膜。取0.5mL的供试菌液加入到4.5mL的人工胃液中，震荡10s后放入37℃厌氧培养，在处理0h、1h、2h、3h取样，测活菌数totalviablecounts。人工肠液：NaHCO31.1g100mL，NaCl0.2g100mL，胰蛋白酶trypsin0.1g100mL，猪胆盐1.8g100mL，调整pH值为8.0，过滤除菌备用。取0.5mL的上述3h人工胃液反应液加入到4.5mL的人工肠液中，震荡10s后放入37℃厌氧培养，在处理0h、3h、8h、24h取样，测活菌数totalviablecounts。N0：处理前的活菌数；N1：用PBS或人工胃肠液处理过的活菌数。结果如下图1所示，LactobacillusplantarumZJUFHN9可耐受pH4.0和3.0胃液，3h处理结束时，能保持99％的存活率；对pH2.5的胃液，处理3h后，能保持60％的存活率；pH2.0的胃液处理能使其存活率将至20％，几乎不能存活。如图2所示，将菌株从胃液转运至肠液中处理24h，耐受不同pH胃液的HN9均有不同程度的活菌损失，除pH4.0胃液转运外，pH3.0、2.5和2.0胃液转运后，24h均有15％左右的活菌损失。总体讲，HN9能较好的耐受pH4.0和3.0的胃肠液转运，对pH2.5的胃肠液转运有一定的耐受能力。5、黏附能力测定凝集特性取108cfumL的菌悬液4ml加入无菌离心管中，在4、8、18和24h静置状态下取上层清液150uL加入到96孔板中，测定OD600nm值。A0：0h时样品的OD值；At：不同时间段样品的OD值。相同体积500uL的植物乳杆菌和病原菌混合，放置在室温下勿摇动，在4h静置状态下取上层清液150uL加入到96孔板中，测定OD600nm值。Apat：病原菌0h时OD值；Aprobio：植物乳杆菌0h时OD值；Amix：病原菌和植物乳杆菌混匀4h的OD值。如图3所示，植物乳杆菌ZJUFHN9的自凝集率随着时间的增加逐步上升，从4h的36.65％升至24h的83.92％。与肠道致病菌之间的交互凝集作用如下表2所示。表2LactobacillusplantarumZJUFHN9与不同病原菌交互凝集率HN9对革兰氏阴性菌大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌有相对较高的凝集特性，对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌的交互凝集作用较弱，仅有23％和15％的凝集率。植物乳杆菌ZJUFHN9的选择性交互凝集作用能使其在肠道中与革兰氏阴性致病菌特指大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌较好的凝集，排出体外，有利于肠道健康。6、抑菌特性研究使用琼脂孔扩散法Well-diffiisionAgarAssay测定菌株的抑菌能力。取20mL灭菌冷却45℃的TSA培养基与200uL致病菌液1-2*107cfumL—起倒入平板混匀，待凝固后于平板上打孔，孔径为7mm。将已制备好的无菌上清液将培养好的菌液离心，取上清液用0.22um的微孔滤膜过滤除菌，置于-80℃备用100uL分别加入孔中，以等体积已灭菌的PBS为对照，置于4℃下扩散12h，取出放入37℃培养24h。测量其抑菌圈直径。表3LactobacillusplantarumZJUFHN9抑制致病菌能力由上表可知，LactobacillusplantarumZJUFHN9对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和李斯特菌4种常见致病菌具有一定的抑制能力，其中对鼠伤寒沙门氏菌的抑制能力最强。7、LactobacillusplantarumZJUFHN9发酵乳能力活化后的HN9和LGG鼠李糖乳杆菌，对照菌株调整菌浓度并用生理盐水进行清洗2次，加入到200mL的脱脂乳培养基脱脂乳11.5％，葡萄糖0.75％，蔗糖5％wv中，使最终菌浓度为1.5-2*107cfumL脱脂乳，每种处理做3个平行，放置在37℃中培养，并于0、6、12、18、24h取样测定发酵指标，随后放置在4℃冰箱中，于1周、2周后取样测定，结果参见图4-9和表4。如图4、5所示，LactobacillusplantarumZJUFHN9发酵乳过程中，使pH从6.6降低到4.3左右，且在保存过程中抑制维持4.3左右。与阳性对照菌株LGG相比，LactobacillusplantarumZJUFHN9降低pH相对较缓慢，保存过程维持在4.3左右。如图6、7所示，发酵乳过程中TTA从18增加到108。与阳性对照菌株LGG相比，LactobacillusplantarumZJUFHN9前期增加比TTA缓慢，但18h后增速比LGG快，最后均维持在112左右。如图8、9所示，发酵乳过程中，LactobacillusplantarumZJUFHN9具有相对LGG较高的蛋白水解能力。从整个发酵周期及保存周期来看，LactobacillusplantarumZJUFHN9分解得到的丝氨酸含量均显著高于LGGp0.05，说明此LactobacillusplantarumZJUFHN9具有较高的分解蛋白的能力。表4LactobacillusplantarumZJUFHN9发酵乳菌落分析由上表可知，37℃发酵24h结束时，LactobacillusplantarumZJUFHN9活菌数显著低于LGG，在后期4℃保存中，虽然两种菌的活菌都有所下降，但LactobacillusplantarumZJUFHN9活菌数仍低于LGG。序列表110浙江大学，浙江全植生物科技有限公司120植物乳杆菌ZJUFHN9及其应用1412017-12-221601170SIPOSequenceListing1.021012111490212DNA213LactobacillusplantarumZJUFHN94001cttaggcggctggttcctaaaaggttaccccaccgactttgggtgttacaaactctcatg60gtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcg120attactagcgattccgacttcatgtaggcgagttgcagcctacaatccgaactgagaatg180gctttaagagattagcttactctcgcgagttcgcaactcgttgtaccatccattgtagca240cgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccgg300tttgtcaccggcagtctcaccagagtgcccaacttaatgctggcaactgataataagggt360tgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcac420cacctgtatccatgtccccgaagggaacgtctaatctcttagatttgcatagtatgtcaa480gacctggtaaggttcttcgcgtagcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgg540gcccccgtcaattcctttgagtttcagccttgcggccgtactccccaggcggaatgctta600atgcgttagctgcagcactgaagggcggaaaccctccaacacttagcattcatcgtttac660ggtatggactaccagggtatctaatcctgtttgctacccatactttcgagcctcagcgtc720agttacagaccagacagccgccttcgccactggtgttcttccatatatctacgcatttca780ccgctacacatggagttccactgtcctcttctgcactcaagtttcccagtttccgatgca840cttcttcggttgagccgaaggctttcacatcagacttaaaaaaccgcctgcgctcgcttt900acgcccaataaatccggacaacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgta960gttagccgtggctttctggttaaataccgtcaatacctgaacagttactctcagatatgt1020tcttctttaacaacagagttttacgagccgaaacccttcttcactcacgcggcgttgctc1080catcagactttcgtccattgtggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtttgggc1140cgtgtctcagtcccaatgtggccgattaccctctcaggtcggctacgtatcattgccatg1200gtgagccgttaccccaccatctagctaatacgccgcgggaccatccaaaagtgatagccg1260aagccatctttcaagctcggaccatgcggtccaagttgttatgcggtattagcatctgtt1320tccaggtgttatcccccgcttctgggcaggtttcccacgtgttactcaccagttcgccac1380tcactcaaatgtaaatcatgatgcaagcaccaatcaataccagagttcgttcgacttgca1440tgtattaggcacgccgccagcgttcgtcctgagccagattccaaactctc1490

权利要求：1.一种植物乳杆菌LactobacillusplantarumZJUFHN9，该植物乳杆菌的保藏号为CCTCCNO:M2017341。2.如权利要求1所述的植物乳杆菌ZJUFHN9在制备抑制胃肠道致病菌的药物或食品中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述胃肠道致病菌为鼠伤寒沙门氏菌。4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述胃肠道致病菌为大肠杆菌。5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物由植物乳杆菌ZJUFHN9菌剂与在药学上可接受的载体组成。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述植物乳杆菌ZJUFHN9菌剂为将含有所述植物乳杆菌ZJUFHN9的菌液通过冷冻干燥制得的粉剂，其中含有＞1011CFUg的活性植物乳杆菌ZJUFHN9。7.如权利要求1所述的植物乳杆菌ZJUFHN9在生产发酵乳制品中的应用。

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