申请/专利权人：深圳市慧思基因科技有限公司

申请日：2018-10-23

公开（公告）日：2019-05-31

公开（公告）号：CN109825527A

主分类号：C12N15/867(2006.01)I

分类号：C12N15/867(2006.01)I;C12N15/66(2006.01)I

优先权：

专利状态码：失效-发明专利申请公布后的驳回

法律状态：2023.10.31#发明专利申请公布后的驳回;2019.07.12#实质审查的生效;2019.05.31#公开

摘要：本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种MYCT‑1基因慢病毒表达载体的构建及鉴定方法，本发明的有益效果，采用MYCT‑1基因克隆片段与经酶切线性化的GV218载体按照1:3‑1:9的摩尔比混合，提高了MYCT‑1基因慢病毒表达载体构建成功效率；采用Westernblot方法检测转染293T细胞样品中MYCT‑1基因慢病毒表达载体融合蛋白的表达情况，并用实时荧光定量PCR法进行滴度测定并标定病毒滴度，能够准确的鉴定MYCT‑1基因慢病毒表达载体，并得到高滴度的MYCT‑1基因慢病毒表达载体。

主权项：1.一种MYCT‑1基因慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一，MYCT‑1基因片段的克隆，根据MYCT‑1基因设计引物序列，并在引物序列中引入了交换配对碱基和酶切位点，通过PCR法扩增MYCT‑1基因片段，扩增条件为：94℃5‑8min，94℃20‑50s，55℃30‑40s，72℃1‑5min，进行25‑35个循环后，72℃延伸6‑12min，得到MYCT‑1基因克隆片段；步骤二，MYCT‑1基因慢病毒表达载体的构建，将步骤一得到的MYCT‑1基因克隆片段与经酶切线性化的GV218载体按照1:3‑1:9的摩尔比混合，先在20‑30℃条件下反应20‑40min，然后在40‑45℃条件下反应15‑20min，进行定向连接得到克隆交换液，将克隆交换液转化至大肠杆菌感受态细胞，得到转化的感受态细胞，然后将转化的感受态细胞转移至LB琼脂培养基上35‑40℃培养12‑20h，设计鉴定引物，通过PCR法进行扩增，将阳性克隆进行测序并进行结果比对，筛选得到MYCT‑1基因慢病毒表达载体。

全文数据：一种MYCT-1基因慢病毒表达载体的构建及鉴定方法技术领域本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种MYCT-1基因慢病毒表达载体的构建及鉴定方法。背景技术MYCT-1基因广泛表达与多种正常组织，且在胃癌、喉癌、肝癌、乳腺癌等多种肿瘤组织中存在表达降低现象的基因，是一种潜在的抑癌基因。目前，MYCT-1基因功能及其在肿瘤发生中的可能机制，仍然不是很明确。现有技术中也没有关于MYCT-1基因慢病毒表达载体的构建及鉴定方法的描述，本发明创新的提出了一种高效的MYCT-1基因慢病毒表达载体的构建及鉴定方法。发明内容针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供MYCT-1基因慢病毒表达载体的构建及鉴定方法。为了实现本发明的目的，本发明采用了如下技术方案：一种MYCT-1基因慢病毒表达载体的构建方法，包括以下步骤：步骤一，MYCT-1基因片段的克隆，根据MYCT-1基因设计引物序列，并在引物序列中引入了交换配对碱基和酶切位点，通过PCR法扩增MYCT-1基因片段，扩增条件为：94℃5-8min，94℃20-50s，55℃30-40s，72℃1-5min，进行25-35个循环后，72℃延伸6-12min，得到MYCT-1基因克隆片段；步骤二，MYCT-1基因慢病毒表达载体的构建，将步骤一得到的MYCT-1基因克隆片段与经酶切线性化的GV218载体按照1:3-1:9的摩尔比混合，先在20-30℃条件下反应20-40min，然后在40-45℃条件下反应15-20min，进行定向连接得到克隆交换液，将克隆交换液转化至大肠杆菌感受态细胞，得到转化的感受态细胞，然后将转化的感受态细胞转移至LB琼脂培养基上35-40℃培养12-20h，设计鉴定引物，通过PCR法进行扩增，将阳性克隆进行测序并进行结果比对，筛选得到MYCT-1基因慢病毒表达载体。优选地，所述步骤一中引物序列包括上游引物SEQIDNO:1和下游引物SEQIDNO:2。优选地，所述步骤二中鉴定引物包括Ubi-FSEQIDNO:3和EGFP-N-RSEQIDNO:4。本发明的另一个目的是提供一种MYCT-1基因慢病毒表达载体的鉴定方法，包括以下步骤：步骤一，将MYCT-1基因慢病毒表达载体转染至293T细胞，24h后荧光显微镜下观察细胞荧光表达情况，筛选得到转染293T细胞，收集转染293T细胞细胞并提取蛋白，采用Westernblot方法检测转染293T细胞样品中MYCT-1基因慢病毒表达载体融合蛋白的表达情况,筛选得到MYCT-1基因慢病毒表达载体融合蛋白过表达的MYCT-1基因慢病毒表达载体；步骤二，将步骤一种得到的MYCT-1基因慢病毒表达载体融合蛋白过表达的MYCT-1基因慢病毒表达载体及其两种辅助包装原件载体质粒pHelper1.0和pHelper2.0，分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染至293T细胞，转染后5-8h转移至完全培养基，培养30-48h后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，对细胞上清液浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液，在293T细胞中以实时荧光定量PCR法进行滴度测定并标定病毒滴度，从而鉴定MYCT-1基因慢病毒表达载体。本发明的有益效果，采用MYCT-1基因克隆片段与经酶切线性化的GV218载体按照1:3-1:9的摩尔比混合，提高了MYCT-1基因慢病毒表达载体构建成功效率；采用Westernblot方法检测转染293T细胞样品中MYCT-1基因慢病毒表达载体融合蛋白的表达情况，并用实时荧光定量PCR法进行滴度测定并标定病毒滴度，能够准确的鉴定MYCT-1基因慢病毒表达载体，并得到高滴度的MYCT-1基因慢病毒表达载体。附图说明图1为本发明实施例MYCT-1基因扩增产物凝胶电泳结果图；图2为本发明实施例GV218-MYCT-1过表达质粒慢病毒的阳性克隆PCR鉴定结果图；图3为本发明实施例质粒转染293T细胞24h荧光表达情况图；图4为本发明实施例Westernblot质粒转染293T细胞样品图；图5为本发明实施例不同浓度病毒感染后样品组的Ct值及表达量分析。具体实施方式以下结合具体实施例对本发明进行详细说明，但是本发明可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。实施例11材料与方法1.1材料慢病毒载体系统和慢病毒的包装细胞293T细胞上海吉凯基因化学技术有限公司；dNTPTakara；琼脂糖赛百盛公司；质粒抽提试剂盒Promega公司；Taq酶Sino－Bio公司；胎牛血清FBS上海微科生化试剂有限公司；DM－SO上海生物试剂厂；DMEMGIBCO公司；胰酶上海化学试剂公司；台盼蓝上海捷倍思基因技术；Lipofectamine2000Invitrogen公司；限制性内切酶NEB公司。1.2方法1.2.MYCT-1基因片段的克隆，引物序列中引入了交换配对碱基和酶切位点，通过PCR法扩增目的基因片段，扩增条件为：94℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃2min，进行30个循环后，72℃延伸10min。1.2.2MYCT-1基因重组慢病毒载体构建，将获得的基因片段与经酶切线性化的GV218载体以1∶3～1∶9的摩尔比加入反应体系进行定向连接，于25℃反应30min后于42℃反应15min制备克隆交换液，将产物转化至大肠杆菌感受态细胞，最后将已转化的感受态细胞转移至LB琼脂培养基上，37℃培养16h。将阳性克隆菌液送公司测序并进行结果比对。1.2.3GV218－MYCT－1慢病毒过表达质粒蛋白表达检测将GV218－MYCT－1慢病毒过表达质粒转染293T细胞，24h后荧光显微镜下观察细胞荧光表达情况。收集细胞，提取蛋白，Westernblot方法检测转染293T细胞样品中MYCT－1－GFP融合蛋白的表达。1.2.4病毒包装、纯化及滴度测定将编码慢病毒颗粒的重组GV218－MYCT－1质粒及其两种辅助包装原件载体质粒pHelper1.0和pHelper2.0，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，按Invitrogen公司Lipofectamine2000使用说明进行共转染293T细胞，转染后8h更换为完全培养基，培养48h后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液，在293T细胞中以实时荧光定量PCR法进行滴度测定并标定病毒滴度。2结果2.1MYCT-1基因扩增产物凝胶电泳结果获得约751bp大小PCR产物，见图1。2.2GV218－MYCT－1过表达质粒慢病毒的阳性克隆鉴定阳性转化子PCR产物大小为912bp，阴性转化子PCR产物大小为198bp，见图2，测序结果与目标序列比对完全一致。2.3GV218－MYCT－1重组质粒293T细胞蛋白表达转染后，细胞内可观察到明显的荧光，说明目的质粒转染正常、目的质粒荧光标记基因表达正常，见图3。转染293T的样品经Westernblot检测，可以观察到52×103附近处有特征条带，其大小和目的基因融合蛋白相吻合，见图4。在本次滴度检测中，1×10－4μL组样品和对照组样品的Ct值存在2个左右差异，认为在1×10－4μL组样品中存在病毒颗粒。假定该组样品含有至少有1个病毒颗粒，则病毒的滴度为2×108TUmL，见图5。以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的简单修改或变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。序列表一种MYCT-１基因慢病毒表达载体的构建及鉴定方法2018-10-044SIPOSequenceListing1.0149DNA人工序列1gaggatccccgggtaccggtcgccaccatgcgaacacaagtatatgagg49239DNA人工序列2tcaccatggtggcgaccggggaatctgggaatgccttga39323DNA人工序列3gggtcaatatgtaattttcagtg23421DNA人工序列4ctggtcgagctggacggcgac21

权利要求：1.一种MYCT-1基因慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一，MYCT-1基因片段的克隆，根据MYCT-1基因设计引物序列，并在引物序列中引入了交换配对碱基和酶切位点，通过PCR法扩增MYCT-1基因片段，扩增条件为：94℃5-8min，94℃20-50s，55℃30-40s，72℃1-5min，进行25-35个循环后，72℃延伸6-12min，得到MYCT-1基因克隆片段；步骤二，MYCT-1基因慢病毒表达载体的构建，将步骤一得到的MYCT-1基因克隆片段与经酶切线性化的GV218载体按照1:3-1:9的摩尔比混合，先在20-30℃条件下反应20-40min，然后在40-45℃条件下反应15-20min，进行定向连接得到克隆交换液，将克隆交换液转化至大肠杆菌感受态细胞，得到转化的感受态细胞，然后将转化的感受态细胞转移至LB琼脂培养基上35-40℃培养12-20h，设计鉴定引物，通过PCR法进行扩增，将阳性克隆进行测序并进行结果比对，筛选得到MYCT-1基因慢病毒表达载体。2.根据权利要求1所述的MYCT-1基因慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于，所述步骤一中引物序列包括上游引物SEQIDNO:1和下游引物SEQIDNO:2。3.根据权利要求1所述的MYCT-1基因慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于，所述步骤二中鉴定引物包括Ubi-FSEQIDNO:3和EGFP-N-RSEQIDNO:4。4.一种MYCT-1基因慢病毒表达载体的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一，将MYCT-1基因慢病毒表达载体转染至293T细胞，24h后荧光显微镜下观察细胞荧光表达情况，筛选得到转染293T细胞，收集转染293T细胞细胞并提取蛋白，采用Westernblot方法检测转染293T细胞样品中MYCT-1基因慢病毒表达载体融合蛋白的表达情况,筛选得到MYCT-1基因慢病毒表达载体融合蛋白过表达的MYCT-1基因慢病毒表达载体；步骤二，将步骤一种得到的MYCT-1基因慢病毒表达载体融合蛋白过表达的MYCT-1基因慢病毒表达载体及其两种辅助包装原件载体质粒pHelper1.0和pHelper2.0，分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染至293T细胞，转染后5-8h转移至完全培养基，培养30-48h后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，对细胞上清液浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液，在293T细胞中以实时荧光定量PCR法进行滴度测定并标定病毒滴度，从而鉴定MYCT-1基因慢病毒表达载体。

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