申请/专利权人：中国科学院烟台海岸带研究所

申请日：2017-12-01

公开（公告）日：2019-06-11

公开（公告）号：CN109868231A

主分类号：C12N1/20(2006.01)I

分类号：C12N1/20(2006.01)I;B09C1/10(2006.01)I;C02F3/34(2006.01)I;C02F101/34(2006.01)N;C02F101/36(2006.01)N;C02F101/38(2006.01)N;C12R1/01(2006.01)N

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2022.05.06#授权;2019.07.05#实质审查的生效;2019.06.11#公开

摘要：本发明涉及微生物领域，尤其是涉及一种贪铜菌Cupriavidus及其应用。贪铜菌Cupriavidus已保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2017年9月25日，保藏编号：CCTCC M 2017546。本发明所得菌株降解2‑氯‑4‑硝基酚以偏苯三酚为开环底物，本发明菌株为经偏苯三酚途径代谢2‑氯‑4‑硝基酚的革兰氏阴性细菌。另一方面，利用制备的修复菌剂在12天内能够完全降解污染土壤中100ppm的2‑氯‑4‑硝基酚。所以，该菌株在2‑氯‑4‑硝基酚污染的生物治理中具有很好的应用前景。

主权项：1.一种贪铜菌Cupriavidus，其特征在于：贪铜菌Cupriavidus已保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2017年9月25日，保藏编号：CCTCC M 2017546。

全文数据：一种贪铜菌Cupriavidus及其应用技术领域本发明涉及微生物领域，尤其是涉及一种贪铜菌Cupriavidus及其应用。背景技术目前，氯代硝基芳香化合物大量的生产，被广泛应用于农业、工业和制药业等行业。这类化合物大多是对人体有毒的化合物，并且在食物链中具有富集和放大效应，具有血液毒性、免疫毒性，肝脏毒性、肾脏毒性、致畸性和致癌性，严重威胁人类的健康和生存。人工合成的氯代硝基芳香化合物在使用时不可避免的会泄漏到环境中，并且发生意外时会大量的泄漏，造成严重的环境污染。2-氯-4-硝基酚属于一种典型的氯代硝基芳香化合物，是重要的的化工原料，常作为染料、医药、农药等合成的前体，还广泛应用与光化学品生成和用作生物检测试剂。目前，该化合物已通过农业应用、工业废水等多种途径进入环境，成为严重影响人类健康的一种污染物。目前，国内外处理2-氯-4-硝基酚的技术有物理化学降解和生物降解。物理化学法运行成本高、易产生二次污染，而且不能将2-氯-4-硝基酚完全矿化。基于微生物的生物修复是一种环保型修复技术，该技术治理成本低，操作简单，二次污染小，而且通过微生物代谢能将环境中的2-氯-4-硝基酚污染物彻底矿化。所以，微生物修复在2-氯-4-硝基酚污染物治理中将会有广阔的前景。由于氯和硝基的吸电子特性极其2-氯-4-硝基酚中硝基和羟基的立体结构特征，增加了2-氯-4-硝基酚生物降解的难度。至今，仅分离出4株能完全降解2-氯-4-硝基酚的纯培养物。但是，研究报道当2-氯-4-硝基酚的浓度达到或超过0.5mM时，以上细菌都不能降解2-氯-4-硝基酚。发明内容本发明的目的在于提供一种贪铜菌Cupriavidus及其应用。为实现上述目的，本发明采用技术方案为：一种贪铜菌Cupriavidus，其特征在于：贪铜菌Cupriavidus已保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2017年9月25日，保藏编号：CCTCCM2017546。通过常规的革兰氏染色，鉴定降解菌为革兰氏阴性细菌。经细菌16SrDNA鉴定该降解菌属于贪铜菌属Cupriavidussp.。所述贪铜菌在降解2-氯-4-硝基酚中的应用。所述贪铜菌在修复经2-氯-4-硝基酚污染的土壤或水体中的应用。一种降解2-氯-4-硝基酚的制剂，制剂为保藏编号为CCTCCM2017546的贪铜菌Cupriavidus菌株。制剂为保藏编号为CCTCCM2017546的贪铜菌Cupriavidus菌株营养细胞或完整培养物。制剂为保藏编号为CCTCCM2017546的贪铜菌Cupriavidus菌株的培养物浓缩物或菌悬液、发酵液或发酵上清液。一种降解2-氯-4-硝基酚的方法，将所述菌株或权利要求4-6任意一项所述的制剂施入待修复的样品中通过偏苯三酚开环降解途径降解样品中的2-氯-4-硝基酚。本发明所具有的优点：本发明获得贪铜菌菌株能够在广泛温度20-40℃和pH5-10范围内，完全降解2-氯-4-硝基酚，该菌株降解2-氯-4-硝基酚最高浓度可以达到1.6mM，是目前报道的2-氯-4-硝基酚降解菌降解最高浓度的3.2倍。其降解污染物2-氯-4-硝基酚的同时利用其作为唯一的碳源，氮源和能源生长，并且该菌株是第一株通过偏苯三酚途径降解2-氯-4-硝基酚的革兰氏阴性细菌，而且该菌株对2-氯-4-硝基酚污染土壤的生物修复效果非常好，这为生物治理这类污染物提供了菌种资源。附图说明图1为本发明是实例提供的菌株对2-氯-4-硝基酚的降解效果图A：2-氯-4-硝基酚浓度为0.3mM；B：2-氯-4-硝基酚浓度为0.05-2mM。图2为本发明是实例提供的GC-MS鉴定菌株降解2-氯-4-硝基酚的中间代谢产物效果图A：乙酰化2-氯对苯二酚标准品；B：乙酰化代谢产物I；C：乙酰化偏苯三酚标准品；D：乙酰化代谢产物II；。图3为本发明是实例提供的不同土壤微模型中2-氯-4-硝基酚的降解效果图。具体实施方式下面结合附图和实施例对本发明做进一步的解释说明。实施例1：菌株的分离、纯化与鉴定1配置无机盐培养基：无机盐培养基成份为磷酸氢二钠Na2HPO4·12H2O14.3g；磷酸二氢钾KH2PO43g；硫酸镁MgSO4·7H2O0.06mg；硫酸亚铁FeSO4·7H2O0.3mg；硫酸锰MnSO4·H2O0.28mg；硫酸铜CuSO40.05mg；硫酸锌ZnSO40.05mg；硼酸H3BO30.05mg。以上成份用双蒸水溶解并定容至1000ml，调节到pH7.0，121℃高压灭菌20分钟。22-氯-4-硝基酚降解菌的富集：从农药制造厂污染的土壤取样，将5g土壤加入到装有100mL无机盐培养基的250ml锥形瓶中，并添加0.3mM的2-氯-4-硝基酚作为唯一的碳源和氮源，置于180rpm的摇床中，30℃培养10-15天。待2-氯-4-硝基酚黄色脱去后，取10％上述培养后的富集液接入新鲜的无机盐培养基中含0.3mM的2-氯-4-硝基酚，继续传代培养，如此重复5次。32-氯-4-硝基酚降解菌的分离取富集培养后的菌液0.1mL加入0.9mL无机盐培养基，依次稀释成10-2、10-3、10-4梯度稀释液，然后稀释液分别涂布于含0.3mM的2-氯-4-硝基酚无机盐固体平板无机盐固体培养基由上述液体无机盐培养基中加入1.5％琼脂粉。30℃恒温培养5-7天，然后将分离纯化的菌种逐个接种到含2-氯-4-硝基酚0.3mM的新鲜的无机盐液体培养基中，置于180rpm的摇床中，30℃培养，通过观察2-氯-4-硝基酚的褪色和培养液的浑浊度，筛选2-氯-4-硝基酚降解菌CNP-8。4菌株的鉴定上述筛选菌株菌落呈白色，光滑，边缘整齐。菌体呈短杆状，革兰氏染色阴性。采用细菌基因组DNA提取试剂盒制备菌株的基因组，以细菌16SrDNA通用引物27F5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3和1492R5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3为扩增引物，细菌基因组DNA为模版，通过PCR扩增降解菌的的16SrDNA约1500bp片段，送交测序公司测序。利用美国生物信息学中心NCBI的BLAST程序对该菌的16SrDNA序列和GenBank已经收录的序列进行核苷酸同源性比较，发现与之序列同源性达到﹥98％的菌种并已经验证的菌种是贪铜菌属Cupriavidussp.。所以鉴定该菌株为贪铜菌，并命名为CNP-8；其已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2017年9月25日，保藏编号：CCTCCM2017546。实施例2：菌株对2-氯-4-硝基酚降解能力分析和代谢中间产物鉴定1降解能力分析将上述单菌落接种在无机盐培养基+LB体积比＝4：1里，并添加0.3mM的2-氯-4-硝基酚，过夜培养后收集菌体，用无机盐培养基清洗2次，然后按初始OD600＝0.05接种量接种至新鲜的无机盐培养基添加0.3mM的2-氯-4-硝基酚，置于180rpm的摇床中，30℃培养并间隔取样，12000rpm离心，收集上清。利用HPLC检测上清中2-氯-4-硝基酚的浓度，用亚硝酸根试剂：1％的氨基苯磺酸和0.02％的N-1-萘乙二胺来检测亚硝酸根，用氯离子选择性电极检测氯离子，用分光光度计检测菌浓度OD600。该菌株能利用2-氯-4-硝基酚作为唯一的碳源，氮源和能源生长，并伴有亚硝酸根和氯离子的生成图1。此外，添加不同浓度的2-氯-4-硝基酚至0.05-2mM无机盐培养基中测定菌株降解底物的能力。该菌株降解2-氯-4-硝基酚最高浓度可以达到1.6mM。2降解条件优化调节无机盐培养基的pH值4，5，6，7，8，9，10，接种菌株到以上培养基中至初始OD600＝0.05，并添加0.3mM的2-氯-4-硝基酚，然后置于180rpm的摇床中，30℃培养，测定2-氯-4-硝基酚完全脱色所需的时间，并计算不同pH时的降解速率。在pH5-10时，菌株能完全降解2-氯-4-硝基酚，并且最适pH为7。同时，当培养基pH固定在7时，该菌株在20，25，30，35和40℃都能很好的降解2-氯-4-硝基酚表1。3中间代谢产物鉴定按照上述的培养方式以2-氯-4-硝基酚作为唯一碳源、氮源和能源生物无机盐培养基中生长，定时取样，12000rpm离心，收集上清。向20ml上清液中加入1ml10％的Na2CO3和1ml乙酸苷对中间代谢产物进行乙酰化。反应30min后，加入5ml正戊烷进行萃取，并利用N2对萃取液进行浓缩。气相色谱-质谱GC-MS鉴定到两个化合物，分别是乙酰化的2-氯-对苯二酚和乙酰化的偏苯三酚图2，因此该菌株是通过偏苯三酚开环途径降解2-氯-4-硝基酚。本发明菌株是目前为止，第一株通过偏苯三酚开环降解2-氯-4-硝基酚的革兰氏阴性细菌。表1.不同pH和温度条件下菌株对2-氯-4-硝基酚0.3mM的降解实施例3：贪铜菌CNP-8修复2-氯-4-硝基酚污染土壤1土壤采集和土壤理化指标测定土壤样品采于中国农业大学烟台校园内，无2-氯-4-硝基酚污染的历史，为去掉表层土采集0-15cm的土壤。经过2mm孔径筛后收集，并于4℃保存。经测试，土壤全碳、全氮含量以及含水量分别为0.86％、0.074％以及10.64％，pH值为7.38。2接入菌的制备将菌株分别用液体LB培养基或无机盐+LB体积比＝4:1，同时加入0.3mM2-氯-4-硝基酚培养至对数后期，6000×g离心8min收集菌体，然后用0.85％的无菌生理盐水清洗两次后，待用。3土壤微环境系统模型的建立另取110.6g湿土相当于100g干重置于带有塑料可旋盖的250mL的玻璃瓶中，室温孵育48h后，接入接种菌至相应的处理组中，1g干重土壤接种菌浓度为1x109菌落形成单位。实验分为六个处理组：1T1，自然土壤上述中国农业大学校园内采集的土壤+2-氯-4-硝基酚；2T2，灭菌土壤自然土壤经过121灭菌30分钟，重复3次灭菌+2-氯-4-硝基酚；3T3，自然土壤+2-氯-4-硝基酚+未诱导的CNP-8细胞1g干重土壤接种菌浓度为1x109菌落形成单位；4T4，自然土壤+2-氯-4-硝基酚+诱导后的CNP-8细胞；5T5，灭菌土壤+2-氯-4-硝基酚+未诱导的CNP-8细胞；6T6，灭菌土壤+2-氯-4-硝基酚+诱导后CNP-8细胞。每个处理均设了三个重复。每个处理中2-氯-4-硝基酚浓度均为100ppm。上述未诱导的CNP-8细胞为培养于LB培养基中的上述筛选获得CNP-8菌株培养条件为30℃，180rpm；上述诱导后CNP-8细胞为培养于无机盐+LB体积比＝4:1，同时加入0.3mM2-氯-4-硝基酚中的上述筛选获得CNP-8菌株培养条件为30℃，180rpm。相对应的，将相同体积的无菌生理盐水加入到未接入接种菌的两种处理中T1和T2，最终，几个处理的含水量全部调为20％，然后将玻璃瓶放在30℃的培养箱中培养。间隔时间称取0.5g土壤样品，每个处理取3个重复，然后加入1mL的甲醇，剧烈振荡20min，13,000×g离心20min后，取800μL的上清于新的1.5mL的离心管中，再次13,000×g离心20min，移取400μL的上清，并利用高效液相色谱检测样品中2-氯-4-硝基酚的浓度检测。高效液相色谱采用C18反向色谱柱5μm孔径，4.6x250mm；购买于安捷伦公司，流动相为50％的甲醇和50％的0.1％的冰醋酸，流速为1mLmin-1，检测波长为320nm。接种了外源菌株的生物处理组T3，T4，T5和T6中的2-氯-4-硝基酚被很快降解，而未接种外源菌株的处理组T1和T2中2-氯-4-硝基酚经过16天降解极少图3。此外，菌株经2-氯-4-硝基酚诱导后再接种污染土壤T4和T6，底物的降解速度相比未诱导组T3和T5要快很多。这说明，本发明菌株，特别是预先诱导后的菌株具有很好的修复2-氯-4-硝基酚污染土壤的潜力。由上述可见将所得菌株制备成修复菌剂可在12天内能够完全降解污染土壤中100ppm的2-氯-4-硝基酚。进而，该菌株在2-氯-4-硝基酚污染的生物治理中具有很好的应用前景。

权利要求：1.一种贪铜菌Cupriavidus，其特征在于：贪铜菌Cupriavidus已保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2017年9月25日，保藏编号：CCTCCM2017546。2.按权利要求1所述的贪铜菌Cupriavidus的应用，其特征在于：所述贪铜菌在降解2-氯-4-硝基酚中的应用。3.按权利要求2所述的贪铜菌Cupriavidus的应用，其特征在于：所述贪铜菌在修复经2-氯-4-硝基酚污染的土壤或水体中的应用。4.一种降解2-氯-4-硝基酚的制剂，其特征在于：制剂为保藏编号为CCTCCM2017546的贪铜菌Cupriavidus菌株。5.按权利要求4所述的降解2-氯-4-硝基酚的制剂，其特征在于：制剂为保藏编号为CCTCCM2017546的贪铜菌Cupriavidus菌株营养细胞或完整培养物。6.按权利要求45所述的降解2-氯-4-硝基酚的制剂，其特征在于：制剂为保藏编号为CCTCCM2017546的贪铜菌Cupriavidus菌株的培养物浓缩物或菌悬液、发酵液或发酵上清液。7.一种降解2-氯-4-硝基酚的方法，其特征在于将权利要求1所述菌株或权利要求4-6任意一项所述的制剂施入待修复的样品中通过偏苯三酚开环降解途径降解样品中的2-氯-4-硝基酚。

百度查询： 中国科学院烟台海岸带研究所 一种贪铜菌（Cupriavidus）及其应用

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