申请/专利权人：浙江大学

申请日：2019-07-05

公开（公告）日：2019-09-13

公开（公告）号：CN110229883A

主分类号：C12Q1/6883(20180101)

分类号：C12Q1/6883(20180101);C12Q1/6851(20180101)

优先权：

专利状态码：失效-发明专利申请公布后的撤回

法律状态：2020.10.02#发明专利申请公布后的撤回;2019.10.15#实质审查的生效;2019.09.13#公开

摘要：本发明公开了一种PRRT4用于诊断肝衰竭的新用途及试剂盒及试剂盒用于诊断肝衰竭的应用。本发明通过高通量mRNA测序结合生物信息学方法筛选到基因PRRT4，进而通过荧光定量PCR方法验证了PRRT4分子与肝衰竭具有很好的相关性，可用于诊断肝衰竭，具有重要的临床应用价值。本发明还公开了一种用于诊断肝衰竭的试剂盒，所述试剂盒包含PRRT4的检测试剂。本发明的PRRT4mRNA诊断试剂盒可采用各种样本，如外周血单个核细胞、血清、血浆等样本进行检测，易于提取，创伤性小，可操作性强，试剂盒方法简便，检测过程简单、易于重复，具备专业资格的技术人员均可以完成，可行性强。

主权项：1.一种PRRT4分子在患者样本中高表达用于诊断肝衰竭的新用途。

全文数据：一种PRRT4用于诊断肝衰竭的新用途及试剂盒及试剂盒用于诊断肝衰竭的应用技术领域本发明涉及临床医学、生物医学和医学检验技术领域，具体地说，是一种检测PRRT4分子用于诊断肝衰竭的新用途及试剂盒及试剂盒用于诊断肝衰竭的应用。背景技术肝功能衰竭是一类各种原因引起的肝脏大面积坏死所致的疾病，病情凶险，患者多于短期内死亡，常规内科综合治疗病死率高达50％-90％。除原位肝移植外，目前尚缺乏特异性治疗方法。但由于严重的供肝短缺，大量患者在等待肝移植的过程中死去。目前临床用于诊断肝衰竭的方法是基于生化指标中的总胆红素传统的凝血指标，如凝血国际标准化比例、凝血酶原活动度等。出现这些指标的显著异常，通常患者已出现明显肝细胞坏死，全身细胞因子风暴，肝脏代谢、解毒功能显著降低，进入病情迅速进展阶段，难以控制，对治疗造成了很大的困难。因此，对肝衰竭进行早期诊断，对实现早期治疗，降低病死率具有极其重要的意义。随着生物技术和分子医学的发展，基于基因或蛋白分子检测的肿瘤诊断方法和试剂等在临床上目前已得到了应用，对提高患者的诊断和治疗效果，发挥了重要作用。在人类基因组序列中，只有不到2％是编码序列，mRNA为编码序列转录后形成的具有编码蛋白质功能的RNA，mRNA在生命的进程、疾病的发生发展中都发挥了重要作用，其异常表达则会造成各类疾病的发生。相比DNA突变等检测手段，mRNA具有更好的生物学功能。本课题组研究发现PRRT4参与肝衰竭发生、发展中的众多环节，与肝衰竭过程中的核心功能，如免疫、凋亡和代谢等多个生物学途径密切相关，因此，PRRT4可以作为一种早期诊断肝衰竭的指标，具有潜在的应用价值。发明内容本发明的第一目的是针对现有技术的不足，提供一种PRRT4分子的检测在诊断肝衰竭疾病中的应用，第二目的是提供一种用于检测PRRT4mRNA的诊断试剂盒。为实现上述第一目的，本发明通过高通量mRNA测序结合生物信息学方法筛选到基因PRRT4，进而通过荧光定量PCR方法验证了PRRT4分子与肝衰竭具有很好的相关性，可用于诊断肝衰竭，具有重要的临床应用价值。进一步，检测样本为细胞、组织样本和体液样本。所述样本包括并不局限于血清样本、血浆样本和外周血单个核细胞样本。为实现上述第二目的，本发明采取的技术方案是：一种用于诊断肝衰竭的试剂盒，所述试剂盒包含PRRT4的检测试剂。本发明的具体技术方案如下：一种PRRT4分子作为肝衰竭样本在诊断肝衰竭中的新用途。作为进一步地改进，本发明所述样本来自于肝衰竭患者或肝衰竭高危人群。作为进一步地改进，本发明所述样本为细胞样本、组织样本或体液样本。作为进一步地改进，本发明所述体液样本优选为血液样本，所述血液样本为血清样本或血浆样本；所述的细胞样本为外周血单个核细胞样本；组织样本为肝组织样本。本发明还公开了一种用于诊断肝衰竭的试剂盒，所述试剂盒包含PRRT4的检测试剂。作为进一步地改进，本发明所述检测试剂包含：aPRRT4扩增引物对；和或bPCR扩增所需试剂；和或c内参引物对和或标准品；d完成检测必须的辅助试剂。作为进一步地改进，本发明所述的检测试剂包含：a如SEQIDNO.1前引物和SEQIDNO.2后引物所示的用于扩增PRRT4的引物对；和或b对mRNA进行反转录的试剂及对反转录产物进行特异性PCR扩增的试剂；和或c如SEQID.NO.3前引物和SEQIDNO.4后引物所示的内参引物对；d完成PCR实验所需的必要溶剂和完成PCR实验所需的扩增核酸和完成RNA抽提的试剂。作为进一步地改进，本发明所述试剂盒包含：2.5UμlPolyA聚合酶、逆转录酶、5×逆转录缓冲液、去RNA酶水、2×qPCR混合液、如SEQIDNO.1前引物和SEQIDNO.2后引物所示的用于扩增PRRT4的引物对、如SEQID.NO.3前引物和SEQIDNO.4后引物所示的内参引物对、血清裂解液、70％乙醇、氯仿、漂洗液、无水乙醇。作为进一步地改进，所述试剂盒包含的PRRT4扩增引物对包括并不限于如SEQIDNO.1前引物和SEQIDNO.2后引物所示的用于扩增PRRT4的引物对，还包括根据PRRT4序列所设计，能有效扩增PRRT4mRNA的引物对；包含的内参引物对包括并不限于如SEQID.NO.3前引物和SEQIDNO.4后引物所示的内参引物对，还包括根据内参序列所设计，能有效扩增内参基因的引物对；包含的标准品包括根据PRRT4序列设计合成的PRRT4mRNA片段；包含的进行PCR反应所需试剂并不限于对mRNA进行反转录的试剂及对反转录产物进行特异性PCR扩增的试剂，还包括能针对PRRT4进行有效PCR扩增反应的试剂和方法。本发明还保护了一种试剂盒用于诊断肝衰竭中的应用，补充试剂盒的应用方法为：所需检测样本，进行RNA提取。将RNA样本1ng-100μg与逆转录酶0.01-10μL，RT混合液0.01-10μL混合后进行反转录，所得产物cDNA与0.2μLPolyA聚合酶0.01-10μL、qPCR混合液0.01-100μL充分混匀后进行PCR扩增。本发明优点在于：1、本发明通过高通量测序联合qPCR验证，发现PRRT4在肝衰竭患者各类样本中呈特征性高表达，与疾病有很好的相关性，稳定可靠。2、本发明的PRRT4mRNA诊断试剂盒可采用各种样本，如外周血单个核细胞、血清、血浆等样本进行检测，易于提取，创伤性小，可操作性强。3、本发明的PRRT4mRNA诊断试剂盒方法简便，检测过程简单、易于重复，具备专业资格的技术人员均可以完成，可行性强。4、本发明的PRRT4mRNA诊断试剂盒能够提供准确的预测结果，及时反映肝衰竭患者的疾病状态，可早期诊断肝衰竭，并指导医生对其进行早期治疗，降低病死率。附图说明图1是肝衰竭n＝20、肝衰竭高危人群n＝10、肝硬化n＝9、慢性乙型肝炎n＝10和健康对照组n＝14的外周血单个核细胞测序数据对照图表；图2是肝衰竭n＝100、肝衰竭高危人群n＝50、肝硬化n＝50、慢性乙型肝炎n＝50和健康对照组n＝45的外周血单个核细胞qRT-PCR验证结果对照图表；图3是在肝衰竭猪模型中，肝衰竭组和正常对照组的PRRT4的检测结果对照图表；图4是在大鼠模型中，肝衰竭组、肝硬化组和正常对照组的PRRT4的检测结果对照图表。具体实施方式下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。本发明实验方法包括：1、基于肝衰竭多中心、前瞻性队列，前期收集肝衰竭、肝损伤、肝硬化、慢性乙型肝炎和健康对照组外周血单个核细胞，通过mRNA测序建立转录组，分析结果发现具有差异的mRNA——PRRT4。2、对肝衰竭、肝损伤、肝硬化、慢性乙型肝炎和健康对照组外周血单个核细胞进行qPCR验证，证实PRRT4在肝衰竭组中高表达。3、PRRT4mRNA诊断试剂盒的制作工艺和操作流程主要是基于PCR技术。通过实验1和实验2步骤筛选出PRRT4mRNA作为预测肝衰竭患者疾病诊断的指标。所述PRRT4扩增引物对序列如SEQIDNO.1前引物和SEQIDNO.2后引物所示的引物对，内参引物对如SEQID.NO.3前引物和SEQIDNO.4后引物的内参引物对所示。下面通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步地说明：实施例一实验方法一、外周血单个核细胞分离1.抽取8mL患者全血，静置约30分钟，离心机常规预冷至4℃。2.采用密度梯度离心机，在4℃，3000转分钟条件下离心5分钟。血细胞沉淀用5mL无菌0.1MPBS缓冲液将血细胞沉淀充分重悬，混匀，形成血细胞悬液后缓慢加入Ficoll-paqueTMPLUSmedium淋巴细胞分离液的离心管中，使其自然形成分层。设置离心机温度20℃，转速为2500转分钟，升速9，降速1，离心20分钟。3.吸取中间白膜层，加入PBS缓冲液10mL，4℃1200转分钟离心4分钟后弃上清。该步骤重复3次。4.用移液枪吸干残留PBS缓冲液，加入1mL细胞裂解液TRIzol使细胞完全裂解。二、总mRNA抽提1.将PBMCs-TRIzol样本于4℃3000转分钟离心3分钟后取出，加入200μL三氯甲烷，剧烈摇荡混匀后静置5分钟使其自然分层。2.将上述样本于4℃12000转分钟条件下离心15分钟后取出，吸取上清约400μL左右，转移至另一清洁1.5mL离心管中。加入500μL异丙醇，缓慢颠倒混匀至澄清液体，静置10分钟。3.将上述样本于4℃12000转分钟条件下离心10分钟后取出，弃去上清。加入1mL75％乙醇溶液，轻轻吹起白色羽毛状沉淀物。4.将上述样本于4℃7500转分钟条件下离心5分钟后取出，弃去上清。5.将上述样本于4℃7500转分钟条件下离心5分钟后取出，用移液枪吸干上清。7.加入30μLDEPC水溶液mRNA。三、mRNA测序1.RNA质检：取1ulRNA溶液于Nanodrop仪器定量。2.根据Nanodrop仪器定量结果，取500ng1％琼脂糖电泳检测。3.依次进行dscDNA合成、末端补平、加A、加接头、PCR富集和Qubit定量4.簇生成：稀释至10nM后取4ul10nM文库，加1ul2NNaOH，加15ulTris.Cl，混匀，室温放置5min；取6ul上述溶液，加994ul冷的杂交buffer；取140ul上述溶液，放在8连管中，置于cBot的template栏中；启动cBot仪器，开始簇生成。5.IlluminaHiseq2500测序图1是肝衰竭n＝20、肝衰竭高危人群n＝10、肝硬化n＝9、慢性乙型肝炎n＝10和健康对照组n＝14的外周血单个核细胞测序数据对照图表；结果筛选出具有特征性表达的的mRNA——PRRT4对照图表，经分析所得，PRRT4mRNA在肝衰竭、肝衰竭高危人群、肝硬化、慢性乙型肝炎和健康对照组的外周血单个核细胞中呈特征性表达，肝衰竭组PRRT4mRNA表达量显著高于其他各组。实施例二实时荧光定量PCRqRT-PCR检测肝衰竭、肝衰竭高危人群、肝硬化、慢性乙型肝炎和健康对照组PRRT4mRNA表达情况。实验步骤qRT-PCR采用两步法进行实验操作。同实施例一方法进行患者外周血单个核细胞分离、总RNA抽提，mRNA经浓度测试后进行下一步实验操作。1.反转录：反转录采用QuantiTectReverseTranscriptionkitQiagen,CA,USA试剂盒，按照试剂盒说明进行操作，得到cDNA。2.取上述cDNA模板进行PCR扩增：PCR试剂采用takara公司TBGreen试剂，操作按照试剂盒说明。图2是肝衰竭n＝100、肝衰竭高危人群n＝50、肝硬化n＝50、慢性乙型肝炎n＝50和健康对照组n＝45的外周血单个核细胞qRT-PCR验证结果对照图表，表明PRRT4在肝衰竭患者中是高表达的；经分析所得，PRRT4mRNA在肝衰竭、肝衰竭高危人群、肝硬化、慢性乙型肝炎和健康对照组的外周血单个核细胞中呈特征性表达，肝衰竭组PRRT4mRNA表达量显著高于其他各组。实施例三试剂盒包含：PRRT4扩增引物如SEQIDNO.1前引物和SEQIDNO.2后引物所示引物对，内参如SEQID.NO.3前引物和SEQIDNO.4后引物所示引物对；2.5UμlPolyA聚合酶、逆转录酶、5×逆转录缓冲液、RT混合液，去RNA酶水5ml、qPCR混合液、吸附柱、细胞裂解液。PRRT4mRNA试剂盒在诊断肝衰竭猪中的应用动物模型：30只雄性中国实验用幼猪8-10公斤随机分成两组，每组15只。试验组：每只幼猪颈静脉注射D-gal1.5gkg，造成肝功能衰竭模型。对照组：注射等量不含PRRT4的生理盐水。分别分离实验组和对照组外周血单个核细胞和血清样本，提取总RNA。将总RNA样本500ng与逆转录酶1μL、5×逆转录缓冲液5μl、RT混合液2μL与去RNA酶水充分混合后进行反转录反应，形成cDNA。上述cDNA样本1μL与0.5μlPolyA聚合酶、8.5ΜlqPCR混合液充分混匀后进行PCR扩增。图3是在肝衰竭猪模型中，肝衰竭组和正常对照组的PRRT4的检测结果对照图表，试验组和对照组于造模后24小时分别取外周血单个核细胞和血清分别进行PRRT4mRNA检测，检测结果显示，试验组外周血单个核细胞PRRT4mRNA的表达量为对照组的12.5倍，血清PRRT4mRNA的表达量为17倍。实施例四试剂盒包含：PRRT4扩增引物如SEQIDNO.1前引物和SEQIDNO.2后引物所示引物对，内参如SEQID.NO.3前引物和SEQIDNO.4后引物所示引物对；2.5UμlPolyA聚合酶、逆转录酶、5×逆转录缓冲液、RT混合液，去RNA酶水5ml、qPCR混合液、吸附柱、细胞裂解液。动物模型：60只雄性SD大鼠8-10公斤随机分成两组，每组20只。肝衰竭组：每只大鼠腹腔注射四氯化碳1ml100g，造成肝衰竭模型。肝损伤组：每只大鼠腹腔注射四氯化碳0.3ml100g，造成肝损伤模型。对照组：每只大鼠腹腔注射等量生理盐水。分别分离肝衰竭组、肝损伤组和对照组外周血全血样本，分离血浆后提取总RNA。将总RNA样本1000ng与逆转录酶1μL、5×逆转录缓冲液5μl、RT混合液1μL与去RNA酶水充分混合后进行反转录反应，形成cDNA。上述cDNA样本2μL与0.2μLPolyA聚合酶、7.8ΜlqPCR混合液充分混匀后进行PCR扩增。图4是在大鼠模型中，肝衰竭组、肝硬化组和正常对照组的PRRT4的检测结果对照图表，各组于造模后12小时取外周血、分离血浆后检测PRRT4mRNA水平，结果显示，肝衰竭组血浆PRRT4mRNA的表达量显著高于肝损伤和对照组。上述实验结果表明：PRRT4mRNA在健康人群、慢性乙型肝炎、肝硬化、肝衰竭高危人群和肝衰竭患者中表达量逐渐升高，通过检测PRRT4的表达水平可检测出肝衰竭和肝衰竭高危患者，从而能帮助该类患者及时进行治疗，具有很好的临床应用前景。本发明开发的PRRT4mRNA诊断肝衰竭试剂盒能够提供准确的评估结果，且能够及时准确反映肝衰竭患者的疾病状态，便于临床医生及时诊断，并采取及时有效的治疗。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。PRRT4引物对序列：SEQIDNO.1：前引物CCCTCAGCTGCAAATCTAGG；SEQIDNO.2:后引物AGGGAGTCCCATTCACACAG内参引物对序列：SEQIDNO.3:前引物CTCTCTGCTCCTCCTGTTCG；SEQIDNO.4:后引物ACGACCAAATCCGTTGACTC。序列表浙江大学一种PRRT4用于诊断肝衰竭的新用途及试剂盒及试剂盒用于诊断肝衰竭的应用4SIPOSequenceListing1.0120DNA人工序列未知1ccctcagctgcaaatctagg20220DNA人工序列未知2agggagtcccattcacacag20320DNA人工序列未知3ctctctgctcctcctgttcg20420DNA人工序列未知4acgaccaaatccgttgactc20

权利要求：1.一种PRRT4分子在患者样本中高表达用于诊断肝衰竭的新用途。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述患者样本来自于肝衰竭患者或肝衰竭高危人群。3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述样本为组织样本或体液样本。4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述体液样本优选为血液样本，所述血液样本为血清样本或血浆样本；所述的细胞样本为外周血单个核细胞样本；组织样本为肝组织样本。5.一种用于诊断肝衰竭的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含PRRT4的检测试剂。6.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于，所述检测试剂包含：aPRRT4扩增引物对；和或bPCR扩增所需试剂；和或c内参引物对和或标准品；d完成检测必须的辅助试剂。7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂包含：a如SEQIDNO.1前引物和SEQIDNO.2后引物所示的用于扩增PRRT4的引物对；和或b对mRNA进行反转录的试剂及对反转录产物进行特异性PCR扩增的试剂；和或c如SEQID.NO.3前引物和SEQIDNO.4后引物所示的内参引物对；d完成PCR实验所需的必要溶剂和完成PCR实验所需的扩增核酸和完成RNA抽提的试剂。8.根据权利要求5或6或7所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含：2.5UμlPolyA聚合酶、逆转录酶、5×逆转录缓冲液、去RNA酶水、2×qPCR混合液、如SEQIDNO.1前引物和SEQIDNO.2后引物所示的用于扩增PRRT4的引物对、如SEQID.NO.3前引物和SEQIDNO.4后引物所示的内参引物对、血清裂解液、70％乙醇、氯仿、漂洗液、无水乙醇。9.根据权利要求5或6或7所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含的PRRT4扩增引物对包括并不限于如SEQIDNO.1前引物和SEQIDNO.2后引物所示的用于扩增PRRT4的引物对，还包括根据PRRT4序列所设计，能有效扩增PRRT4mRNA的引物对；包含的内参引物对包括并不限于如SEQID.NO.3前引物和SEQIDNO.4所示的内参引物对，还包括根据内参序列所设计，能有效扩增内参基因的引物对；包含的标准品包括根据PRRT4序列设计合成的PRRT4mRNA片段；包含的进行PCR反应所需试剂并不限于对mRNA进行反转录的试剂及对反转录产物进行特异性PCR扩增的试剂，还包括能针对PRRT4进行有效PCR扩增反应的试剂和方法。10.一种如权利要求5或6或7所述试剂盒用于诊断肝衰竭中的应用。

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