申请/专利权人：清华大学;杭州捷诺飞生物科技股份有限公司

申请日：2020-10-27

公开（公告）日：2024-06-28

公开（公告）号：CN114381419B

主分类号：C12N5/071

分类号：C12N5/071

优先权：["20201019 CN 202011120076X"]

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.06.28#授权;2022.05.10#实质审查的生效;2022.04.22#公开

摘要：本发明提供一种仿生人工肝组织及其制备方法与应用。本发明提供的仿生人工肝组织含有接近人体天然组织的极高的细胞密度，肝细胞呈现致密排布的特征更，肝组织功能良好。该人工肝组织具有成熟肝组织具有的白蛋白分泌、药物代谢、氮代谢和尿素合成等功能，表达成熟肝细胞的标志性蛋白标记物。本发明提供的构建方法工艺稳定，不仅可以使细胞快速增殖，获得与天然组织类似的极高的细胞密度，且获得的肝组织功能良好。本发明提供的构建方法可根据需要定制化设计、批量化生产。本发明的仿生人工肝组织可用于药物临床前检测、再生医学和体内移植、生物人工肝和肝功能代偿、肝脏疾病研究与治疗、药物测试与新药开发等领域。

主权项：1.仿生人工肝组织，其特征在于，所述仿生人工肝组织的尺寸大小为0.1～50cm，其宏观结构为柱状、块状、片状、囊状、管状、网格状、编织状或任意形状组合；所述仿生人工肝组织包含直径大小为50～2000μm的微丝和内径大小为0.01～300mm的中空通道；其中，所述微丝是由生物相容性材料和细胞通过铸模法或3D打印工艺形成的，呈丝状或圆柱状结构；所述中空通道是由相邻的数根微丝围绕形成的；所述仿生人工肝组织中至少包含肝细胞，肝细胞呈现致密排列特征；所述仿生人工肝组织具有接近人体天然肝组织的极高的细胞密度，细胞密度达到甚至超过107～108个mL量级；所述仿生人工肝组织的杨氏模量为0.1-150Kpa；所述细胞来源于胚胎干细胞、诱导多能干细胞、肝脏干细胞、肝脏祖细胞、内胚层细胞、肝脏内胚层细胞、肝母细胞、间充质干细胞或成体干细胞，以及这些细胞分化得到的肝细胞；人体各种组织来源的肝细胞及其细胞系；以及上述所有细胞经过基因编辑、病毒包装或改造获得的相关细胞；所述细胞还包括胆管上皮细胞、肝星状细胞、肝窦内皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、枯否细胞中的一种或多种，包括上述细胞及其细胞系，以及上述细胞经过基因编辑、病毒包装或改造获得的相关细胞；细胞来源于诱导多能干细胞、胚胎干细胞、肝脏干细胞、肝脏祖细胞、内胚层细胞、肝脏内胚层细胞、间充质干细胞或成体干细胞，由多种细胞分化得到，或人体各种组织获得；所述仿生人工肝组织的制备方法包括：1将生物相容性材料与细胞均匀混合得到含有细胞的前体溶液；2将所述前体溶液按照预先设计的结构制备成三维水凝胶结构体；3对三维水凝胶结构体进行后处理；4三维水凝胶结构体的体外培养和或细胞诱导分化获得仿生人工肝组织；步骤2采用如下方法将所述前体溶液按照预先设计的结构制备成三维水凝胶结构体：铸模法、消失模法、生物3D打印法、喷墨打印法、熔融沉积成型法、静电纺丝法、静电驱动打印法、立体光刻法或激光烧结法；所述方法是通过控制温度使三维结构成型，温度控制范围在0℃～37℃；和或所述方法是通过光处理使三维结构成型；步骤3所述后处理方法包括稳定化处理和或牺牲材料处理；其中，对三维水凝胶结构体进行稳定化处理所用的交联试剂选自二价阳离子、京尼平、戊二醛、已二酸二酰肼、环氧氯丙烷、碳化二亚胺、凝血酶及其衍生物中的至少一种；所述交联试剂的浓度为0.1mM～10M；对三维水凝胶结构体进行牺牲材料处理，包括去除多余材料，所述多余材料包括三维水凝胶结构体中的温敏材料、交联试剂；步骤4对三维水凝胶结构体进行体外培养，包括静置培养和或动态培养；体外培养所用细胞培养液是在基础培养液的基础上添加了诱导肝细胞分化和维持肝细胞功能的因子；其中，所述诱导肝细胞分化和维持肝细胞功能的因子选自骨形态发生蛋白、成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、二甲基亚砜、抑癌蛋白M中的至少一种；其中，所述细胞培养液包含50-120ngml激活素A，10-50ngml骨形态发生蛋白2，10-50ngml骨形态发生蛋白4，10-50ngml成纤维细胞生长因子4，0.1％-2％vv二甲基亚砜，10-50ngml肝细胞生长因子，1×10-5-1×10-4M抑癌蛋白M，1mM抗坏血酸，0.2mMN-乙酰半胱氨酸酰胺和1×10-7M地塞米松；体外培养条件为：35℃～38℃，5％CO2。

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