申请/专利权人：四川省食品发酵工业研究设计院

申请日：2019-05-09

公开（公告）日：2019-10-15

公开（公告）号：CN110331102A

主分类号：C12N1/16(20060101)

分类号：C12N1/16(20060101);A23L27/50(20160101);A23L29/00(20160101);C12R1/645(20060101)

优先权：

专利状态码：失效-发明专利申请公布后的驳回

法律状态：2023.06.06#发明专利申请公布后的驳回;2019.11.08#实质审查的生效;2019.10.15#公开

摘要：本发明属于酱油酿造技术领域，具体为一株异常威克汉姆酵母菌1027JM‑2在酱油酿造中的应用。本发明筛选得到的异常威克汉姆酵母菌1027JM‑2于2019年3月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM2019132，分类命名为：Wickerhamomycesanomalus。本发明中的异常威克汉姆酵母菌株（增香酵母菌）具有较强的NaCl耐受性，完全适用于高盐稀态发酵的NaCl浓度，耐受范围为0%‑22%；温度适应性范围较宽；对于酱油风味的改变能够起到积极作用。

主权项：1.一株异常威克汉姆酵母菌1027JM-2，其特征在于：该菌于2019年3月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM2019132，分类命名为：Wickerhamomycesanomalus。

全文数据：异常威克汉姆酵母菌1027JM-2在酱油酿造中的应用技术领域本发明属于酱油酿造技术领域，具体为一株异常威克汉姆酵母菌1027JM-2在酱油酿造中的应用。背景技术酱油是我国传统的酿造型调味品，历史悠久,从东汉开始，中国便开始了酱油生产，酱油是以蛋白质原料和淀粉质原料为主，经微生物发酵酿造而成的色香味协调、营养物质丰富的调味品。酱油酿造有一谚语：一曲、二醪、三熬油，是对酱油生产工艺的精炼概述，二醪是指制曲后的发酵过程，这个过程是酱油酿造的重要环节，此时，酵母、乳酸菌等作为主体微生物参与整个发酵过程，并且在其作用下，经过一系列复杂的生物化学反应，将黄豆、小麦等原料转化成酱油的成分。目前已明确增香酵母对酱油等食品在酿造过程中风味物质的形成起到重要的作用，增香酵母是一类能够产生芳香气味物质的酵母，在酱油酿造中，酵母菌能够以米曲霉代谢产生的小分子糖类和氨基酸的为基础，产生醇、醛、酸、酚、酯等酱油主要的香气成分。不同酵母对风味的影响不同，如鲁氏酵母菌能大量生成甘油、阿拉伯糖醇、乙醇、异丁醇、异戊醇等醇类物质；结合酵母贯穿整个发酵过程，均能进行酒精发酵，给酱油增加特有的风味；球拟酵母菌主要存在发酵后期，可将葡萄糖分解成大量的甘油、乙醇和4—乙基愈创木酚等香气物质。此外，酵母菌体在后酵后期发生自溶，产生呈味核酸等物质。高盐稀态发酵工艺是一种高品质酱油生产工艺，在发酵过程中，为了提高酱油的风味，要人为进行增香酵母添加，目前国内应用广泛并且有一定效果的为鲁氏酵母，但是，存在酵母在应用过程中是否适应酱油酿造过程中的高盐环境，以及不同菌株之间的差异导致菌株对酱油风味影响不同等问题，因此筛选出一株耐高盐并有效改变酱油风味的菌株是十分必要的。发明内容本发明鉴于现有工业化生产酱油中可应用的增香潜能酵母品种少，生产的酱油香味不足的问题，提供了一株异常威克汉姆酵母菌1027JM-2，以及利用该菌株酿造酱油的方法。该菌株可在酱油酿造高盐环境下生长繁殖，能够有效改变酱油风味，适用于酱油酿造。为了实现以上发明目的，本发明的技术方案为：一株异常威克汉姆酵母菌1027JM-2，该菌于2019年3月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2019132，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学；分类命名为：Wickerhamomycesanomalus1027JM-2。采用异常威克汉姆酵母菌1027JM-2用于酱油酿造的方法，包括以下步骤：以黄豆、面粉为原料，采用米曲霉沪酿3.042为制曲菌种进行制曲，采用高盐稀态发酵工艺发酵，在发酵的初期优选发酵的第50天或中期优选发酵的第61-120天接入异常威克汉姆酵母菌1027JM-2，使酱醩中酵母的含量达到5×105cfug，继续发酵4个月，过滤收集生油，静置澄清即得。高盐稀态发酵工艺为现有技术；酱油酿造技术也为现有技术。作为优选，利用该酵母菌酱油酿造的方法，具体包括以下步骤：以黄豆、面粉为原料，先将黄豆在37℃左右的温水中浸泡4h后，于115℃的条件下灭菌15min，待曲料冷却至40℃左右时，将黄豆按黄豆与面粉质量比为8:1的比例拌入面粉中，再以0.25％以原料总质量计的比例接入米曲霉沪酿3.042种曲，制曲厚度10cm，制曲温度28-30℃，制曲时间40h。在制曲结束后，按照成曲与盐水的质量比为1:2.2的比例加盐水盐水的质量浓度为24.8％，在发酵的前30d内，维持发酵温度15℃，期间每周搅拌2-3次，待发酵30d后将发酵温度升温至28℃继续发酵，期间每月搅拌2-4次，在发酵的第50天时，接入该异常威克汉姆酵母菌1027JM-2，使酱醩中的酵母含量达到5×105cfug左右，继续发酵4个月，过滤收集酱油，静置澄清即得。该增香酵母菌还适用于在泡菜或腌菜类中的发酵增香。该增香酵母菌还适用于在酒类酿造中的发酵增香。本发明的积极效果体现在：一本发明中的异常威克汉姆酵母菌株增香酵母菌在质量浓度为16-18％NaCl存在情况下生长情况良好，在22％氯化钠存在情况下仍能存活。说明本发明的异常威克汉姆酵母菌株有较强的NaCl耐受性，完全适用于高盐稀态发酵的NaCl浓度，耐受范围为0％-22％。二本发明中的异常威克汉姆酵母菌株在22-34℃下生长情况良好，在10℃和38℃下虽然生长受到影响，但仍能保持一定的生长量，其温度适应性范围为10-38℃。说明本发明菌株具有一定的温度适应性，适合在我国南方常温和保温高盐稀态发酵应用。三将异常威克汉姆酵母Wickerhamomycesanomalus菌株1027JM-2运用于酱油酿造技术中，对风味物质3-甲硫基丙醇、苯乙醇、乙酸异戊酯、乙酸苯乙酯、棕榈油酸乙酯、棕榈酸乙酯、油酸乙酯等长链脂肪酸酯类有增强的效果，以上风味物质对酱油风味有重要作用，因此本菌株对于酱油风味的改变能够起到积极作用。附图说明：图1为0％NaCl的YPD培养基上菌株平板图片；图2为8％NaCl的YPD培养基上菌株平板图片；图3为16％NaCl的YPD培养基上菌株平板图片；图4为菌株显微图片；图5为本发明中所述菌株编号为1027JM-2增香酵母菌的发育树。具体实施方式：为了使本发明的发明目的、技术方案及其有益技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。本申请文件中所使用的％，如无特殊说明，均表示其质量百分含量，即wt％。以下实施例中采用的增香酵母菌均指已经保藏的异常威克汉姆酵母菌1027JM-2，该菌于2019年3月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2019132，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学；分类命名为：Wickerhamomycesanomalus1027JM-2。异常威克汉姆酵母菌1027JM-2的培养：1配制YPD液体种子培养基，接入异常威克汉姆酵母菌，于30℃摇瓶发酵培养15h，制成种子培养基；2再次配制YPD液体发酵培养基，以2％的接种量接入种子培养基，于30℃摇瓶发酵培养15h，将发酵液装入无菌离心瓶，4000rmin离心20分钟，收集菌体，以涂布法对菌体数量进行计数。所述YPD培养基为：1-3％葡萄糖，0.5-1.5％酵母膏，0.5-1.5％蛋白胨，天然pH。实施例1：利用增香酵母菌酱油酿造的方法，其步骤为：以黄豆、面粉为原料，先将黄豆在37℃左右的温水中浸泡4h后，于115℃的条件下灭菌15min，待曲料冷却至40℃左右时，将黄豆按黄豆与面粉质量比为8:1的比例拌入面粉中，再以0.25％以原料总质量计的比例接入米曲霉沪酿3.042种曲，制曲厚度10cm，制曲温度28℃，制曲时间40h。在制曲结束后，按照成曲与盐水的质量比为1:2.2的比例加盐水盐水的质量浓度为24.8％，在发酵的前30d内，维持发酵温度15℃，期间每周搅拌2次，待发酵30d后将发酵温度升温至28℃继续发酵，期间每月搅拌3次，在发酵初期的第50天时，接入该增香酵母菌，使酱醩中的酵母含量达到5×105cfug左右，保藏发酵条件不变，继续发酵4个月，过滤收集酱油，静置澄清即得生油样品A。实施例2：利用增香酵母菌酱油酿造的方法，其步骤为：以黄豆、面粉为原料，先将黄豆在37℃左右的温水中浸泡4h后，于115℃的条件下灭菌15min，待曲料冷却至40℃左右时，将黄豆按黄豆与面粉质量比为8:1的比例拌入面粉中，再以0.25％以原料总质量计的比例接入米曲霉沪酿3.042种曲，制曲厚度10cm，制曲温度28℃，制曲时间40h。在制曲结束后，按照成曲与盐水的质量比为1:2.2的比例加盐水盐水的质量浓度为24.8％，在发酵的前30d内，维持发酵温度15℃，期间每周搅拌2次，待发酵30d后将发酵温度升温至28℃继续发酵，期间每月搅拌3次，在发酵第100天即整个发酵中期时接入该增香酵母菌，使酱醩中的酵母含量达到4×105cfug左右，继续发酵5个月，过滤收集酱油，静置澄清即得生油样品B。对比例1：利用增香酵母菌酱油酿造的方法，其步骤为：以黄豆、面粉为原料，先将黄豆在37℃左右的温水中浸泡4h后，于115℃的条件下灭菌15min，待曲料冷却至40℃左右时，将黄豆按黄豆与面粉质量比为8:1的比例拌入面粉中，再以0.25％以原料总质量计的比例接入米曲霉沪酿3.042种曲，制曲厚度10cm，制曲温度28℃，制曲时间40h。在制曲结束后，按照成曲与盐水的质量比为1:2.2的比例加盐水盐水的质量浓度为24.8％，在发酵的前30d内，维持发酵温度15℃，期间每周搅拌2次，待发酵30d后将发酵温度升温至28℃继续发酵，期间每月搅拌3次，继续发酵5个月，过滤收集酱油，静置澄清即得生油阴性对照样品。将实施例1和实施例2中制备得到的生油样品A和生油样品B采用顶空固相微萃取，利用GC-MS测定培养基中香气成分。萃取温度60℃，时间30min。色谱条件：运用SH-Rtx-WAS30m×0.25mm×0.32um，强极性色谱柱；载气为高纯He；流速为1.67mLmin；进样口温度为250℃；升温程序：初始温度45℃，保持3min，以3℃min的速度升温至180℃，保持3min，以12℃min的速度升温至220℃保持3min；质谱条件：离子源温度为200℃；接口温度为250℃；电子轰击离子源EI；检测范围：35-500mz。对采集到的质谱图进行组分和相对含量分析。结果见下表。表1应用增香酵母酱油主要挥发性风味物质相对含量变化从上表可以看出，应用异常威克汉姆酵母菌作为增香菌株进行酱油酿造，菌株能够有效改变生油中醇类和酯类物质的种类，生成以棕榈酸乙酯、十八酸乙酯、亚油酸乙酯、亚麻酸乙酯等长链脂肪酸酯为主的酯类，对酱油酯香改善明显。异常威克汉姆酵母菌1027JM-2菌株的形态学观察及分子鉴定：异常威克汉姆酵母分子生物学鉴定：利用EZneneTMFungalGdnaKitGD2416，BIOMIGA试剂盒方法提取酵母基因组DNA，并使用通用引物NL1NL4NL1：GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG；NL4：GGTCCGTGTTTCAAGACGG对其26SrDNAD1D2区域序列进行特异性扩增，PCR反应条件：94℃for1min；52℃for1min；72℃for1min30sec，36cycle；72℃for5min；4℃save，END。扩增产物经以2％琼脂糖凝胶电泳呈单一条带，无非特异扩增现象，条带长短约550bp，送生工生物测序。将测序得到的基因序列与NCBI数据库中已有序列进行BLAST比对，与异常威克汉姆酵母菌株相似性达到99％，初步确定为异常威克汉姆酵母。为进一步显示供试菌株与己知酵母菌的亲缘关系及系统地位，根据同源性搜索结果，使用MEGA5.0生物学软件对测试菌株和相关菌株的多个序列以neighbour-joining方法建立系统发育树，所构建的系统进化发育树如图5所示，最终确定该菌为异常威克汉姆酵母Wickerhamomycesanomalus。将异常威克汉姆酵母1027JM-2划线于0％、8％、16％NaCl的YPD培养基上，28℃倒置培养70h后，对菌株在各平板上培养特征进行观察。在0％NaCl的YPD培养基上图1，菌落直径2mm，淡黄色，不透明，表面光滑，无光泽，全缘，中央凸起；在8％NaCl的YPD培养基上图2，菌落直径0.8mm，淡黄色，不透明，表面光滑，无光泽，全缘；在16％NaCl的YPD培养基上图3，菌落直径0.2mm，淡黄色，不透明，表面光滑，无光泽，全缘。对菌株1027JM-2进行镜检，其细胞直径5μm，菌体呈球形、椭球型，芽殖。如图4所示。增香酵母菌株耐盐性测试：以YPD液体培养基为基础，添加NaCl，设定盐浓度为10％、13％、16％、18％、20％、22％、24％，灭菌后接入异常威克汉姆酵母置于28℃、160转分摇床观察其生长状况，记录菌液混浊时间，结果如表2所示，本发明所示菌株在18％NaCl以下浓度条件下生长情况良好，在20％、22％NaCl浓度下生长受到抑制，在24％NaCl浓度，生长差。表2菌株耐盐性实验NaCl浓度10％13％16％18％20％22％24％浑浊时间d1d2d3d4d6d7d9d增香酵母温度适应性实验：以YPD液体培养基为基础，灭菌后接入异常威克汉姆酵母，置于温度梯度为10℃、14℃、18℃、22℃、26℃、30℃、34℃、38℃，160转分摇床观察其生长状况，记录菌液混浊时间，结果如表3所示，本发明所示菌株在22-34℃下生长情况良好，在14℃、18℃和38℃下，菌株生长缓慢，在10℃下生长受到明显抑制。表3菌株温度适应性实验温度℃1014182226303438浑浊时间d86531125增香酵母在0％NaCl浓度下YPD培养基中的风味物质分析：从试管斜面上挑取异常威克汉姆酵母菌株一环接种于30mL0％NaCl的YPD液体培养中，于28℃、160转分摇床培养24h。吸取上述培养液1.5mL接种于150mL含0％NaCl的YPD液体培养基中，于28℃、160转分摇床培养6d后，具有浓郁的酯香。采用顶空固相微萃取，利用GC-MS测定培养基中香气成分。萃取温度60℃，时间30min。色谱条件：运用SH-Rtx-WAS30m×0.25mm×0.32um，强极性色谱柱；载气为高纯He；流速为1.67mLmin；进样口温度为250℃；升温程序：初始温度45℃，保持3min，以3℃min的速度升温至180℃，保持3min，以12℃min的速度升温至220℃保持3min；质谱条件：离子源温度为200℃；接口温度为250℃；电子轰击离子源EI；检测范围：35-500mz。对采集到的质谱图进行组分和相对含量分析。结果见表4、表5。表4菌株在0％NaCl的YPD发酵液中主要挥发性风味物质相对含量变化表5菌株在0％NaCl的YPD发酵液中主要醇和酯类相对含量变化从表4可以看出，异常威克汉姆酵母菌株以0％NaCl的YPD液体培养基为发酵底物，通过GC-MS对比发现，菌株能够有效提升发酵液中醇类和酯类物质的种类和相对含量，从表5可以看出，异常威克汉姆酵母菌株以0％NaCl的YPD液体培养基为发酵底物主要产生以苯乙醇为主的醇类，以乙酸苯乙酯、3-苯丙酸乙酯和棕榈酸乙酯为主的酯类。酵母在16％NaCl浓度下YPD培养基中的风味物质分析：从试管斜面上挑取异常威克汉姆酵母菌株一环接种于30mL16％NaCl的YPD液体培养中，于28℃、160转分摇床培养24h。吸取上述培养液1.5mL接种于150mL含16％NaCl的YPD液体培养基中，于28℃、160转分摇床培养6d后，具有浓郁的果香和酯香。采用顶空固相微萃取，利用GC-MS测定培养基中香气成分。萃取温度60℃，时间30min。色谱条件：运用SH-Rtx-WAS30m×0.25mm×0.32um，强极性色谱柱；载气为高纯He；流速为1.67mLmin；进样口温度为250℃；升温程序：初始温度45℃，保持3min，以3℃min的速度升温至180℃，保持3min，以12℃min的速度升温至220℃保持3min；质谱条件：离子源温度为200℃；接口温度为250℃；电子轰击离子源EI；检测范围：35-500mz。对采集到的质谱图进行组分和相对含量分析。结果见表6、表7。表6菌株在16％NaCl的YPD发酵液中主要挥发性风味物质相对含量变化表7菌株在16％NaCl的YPD发酵液中主要醇和酯类相对含量变化从表6可以看出，异常威克汉姆酵母菌株以16％NaCl的YPD液体培养基为发酵底物，通过GC-MS对比发现，菌株能够有效提高发酵液中醇类和酯类物质的种类，从表7可以看出，异常威克汉姆酵母菌株以16％NaCl的YPD液体培养基为发酵底物主要产生以苯乙醇为主的醇类，以乙酸苯乙酯和乙酸异戊酯为主的酯类。根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。SEQUENCELISTING四川省食品发酵工业研究设计院异常威克汉姆酵母菌1027JM-2在酱油酿造中的应用20191PatentInversion3.51541DNA异常威克汉姆酵母菌11acactgcatgcctcgtacggcgagtgagcggcaaaagctcaaatttgaaatctagcacct61tcggtgttcgagttgtaatttgaagatggtaaccttgggtttggctcttgtctatgttcc121ttggaacaggacgtcatagagggtgagaatcccgtctgatgagatgcccattcctatgta181aggtgctatcgaagagtcgagttgtttgggaatgcagctctaagtgggtggtaaattcca241tctaaagctaaatattggcgagagaccgatagcgaacaagtacagtgatggaaagatgaa301aagaactttgaaaagagagtgaaaaagtacgtgaaattgttgaaagggaagggcattaga361tcagacttggtgttttacgattatcttctcttcttgagttgtgcactcgtatttcactgg421gccagcatcgattcggatggcaagataatggcagttgaatgtggcttcacttcggtggag481tgttatagcttctgctgatattgcctgtctggatcgagggctgcgtcttttgactaggat541gctggc

权利要求：1.一株异常威克汉姆酵母菌1027JM-2，其特征在于：该菌于2019年3月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM2019132，分类命名为：Wickerhamomycesanomalus。2.一种利用权利要求1中所述酵母菌进行酱油酿造的方法，其特征在于包括以下步骤：采用高盐稀态发酵工艺进行发酵，在发酵的初期或中期，接入该酵母菌，使酱醩中酵母的含量达到5×105cfug，继续发酵4个月，过滤收集生油，静置澄清即得。3.如权利要求2所述酵母菌进行酱油酿造的方法，其特征在于包括以下步骤：采用高盐稀态发酵工艺进行发酵，在发酵的第50天时，接入该酵母菌，使酱醩中酵母的含量达到5×105cfug，继续发酵4个月，过滤收集生油，静置澄清即得。

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