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申请/专利权人：首都医科大学附属北京口腔医院

摘要：本发明提供一种Ano5基因敲除小鼠模型的构建方法。利用CRISPR‑Cas9基因敲除技术，敲除Ano5基因第11,12外显子。Ano5基因敲除后的小鼠均表现为胫骨侧弯、皮质骨增厚、下颌骨肥大和血液中碱性磷酸酶含量升高等多种人GDD患者临床表现。本发明构建的模拟人GDD疾病的小鼠模型，该模型稳定性强稳定遗传，与人类GDD疾病表现类似，可为进一步研究GDD发病机制以及基因治疗提供经济、简单、可靠的动物模型。

主权项：1.Ano5基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1基于CRISPR-Cas9系统设计靶向Ano5基因的sgRNA；2sgRNA与Cas9核酸酶的mRNA经体外转录后，一起注射到小鼠受精卵中，然后将受精卵移植到假孕母鼠体内，产出F0代，对F0代进行PCR鉴定，将阳性F0代与野生型小鼠交配获得F1代杂合子，F1代杂合子进行杂交，筛选Ano5基因敲除的纯合子代，作为Ano5基因敲除小鼠模型；其中，sgRNA作用位点位于Ano5基因的11和12号外显子上，sgRNA作用位点的DNA序列为5′-GCAAGCCAGATAACATCCCAGG-3′和5′-GCCTAGTGTGCACACATCCCTGG-3′。

全文数据：Ano5基因敲除小鼠模型的构建方法技术领域本发明涉及病理学、遗传学和生物技术领域，具体地说，涉及一种Ano5基因敲除小鼠模型的构建方法。背景技术GDDGnathodiaphysealdysplasia是一种病变累及口腔和长骨的显性遗传性疾病，表现为下颌骨牙骨质骨发育不良或呈颌骨骨髓炎病理改变，管状骨侧弯、骨脆性增加和骨皮质增厚。GDD患者常在青少年时期发生骨折或反复骨折，血中碱性磷酸酶水平增高。Anoctamin5ANO5基因是GDD的致病基因。近年来，有关GDD患病家系和散发病例的相关报道不断出现。由于该病给患者造成极大的痛苦，严重影响其生活质量，因此探讨GDD病因，进而指导疾病诊断、预防和治疗成为学者们关注的重点领域。GDD是一种常染色体显性遗传疾病。2003年，Tsutsumi在一个日本大家系中，首次将致病基因定位于人类染色体11p14.3-15.1区域。随后，2004年在这个日本家系和另一个非裔美籍家系中发现位于ANO5Anoctamin5TMEM16E基因上的两个错义突变p.C356R和p.C356G。2012年，Marconi等在一个意大利GDD家系中，发现了ANO5基因上第三个错义突变p.T513I。前期研究中，发现中国GDD家系中的第一个ANO5基因突变p.C360Y。但迄今为止，对ANO5基因表达产物的功能及基因突变导致GDD的分子机制仍未阐明。ANO5基因位于人类染色体11p14.3-15.1，编码913个氨基酸，属于Anoctamin蛋白家族成员早期命名为TMEM16family。TMEM16基因家族有一个共同特征结构--8个跨膜区域，在第五和第六跨膜区域形成了一个离子通道。在人体组织中，Ano5基因的mRNA在脑、心脏、骨骼肌中检测到表达；在成年小鼠的颅盖骨，股骨和下颌骨中也有表达。根据Tsutsumi等人和Mizuta等人的研究，认为ANO5蛋白可能是一个完整的膜糖蛋白，主要驻留在细胞内的膜性囊泡内和质膜上，可能是内质网，但是具体机制还不清楚，突变是否会导致ANO5蛋白定位发生改变也不清楚。因此，利用动物模型研究GDD疾病可以为人类GDD疾病的诊断、治疗提供理论基础。目前，Ano5基因敲除的动物模型主要有Griffin通过敲除第8、9外显子和Xu通过替换第1外显子及其上游1.6kb序列建立的两种小鼠模型，然而这些模型只介绍了Ano5有关的肌肉相关疾病的表型改变，并未发现有任何骨组织的改变。发明内容本发明的目的是提供一种Ano5基因敲除小鼠模型，特别是模拟人类GDD疾病的小鼠模型的构建方法。为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种用于敲除小鼠Ano5基因的CRISPR-Cas9系统，所述CRISPR-Cas9系统中sgRNA作用位点位于Ano5基因的11和12号外显子上，sgRNA作用位点的DNA序列为5′-CCTGGGATGTTATCTGGCTTGC-3′和5′-CCAGGGATGTGTGCACACTAGGC-3′。第二方面，本发明提供小鼠Ano5基因打靶载体，所述打靶载体是基于CRISPRCas9系统的sgRNA表达载体，sgRNA作用位点位于小鼠Ano5基因的11和12号外显子上，sgRNA作用位点的DNA序列为5′-CCTGGGATGTTATCTGGCTTGC-3′和5′-CCAGGGATGTGTGCACACTAGGC-3′SEQIDNO:1-2。第三方面，本发明提供所述CRISPR-Cas9系统或所述打靶载体在制备Ano5基因敲除的细胞系中的应用。本发明所述细胞系包括但不限于体细胞、生殖细胞。第四方面，本发明提供Ano5基因敲除的细胞系，用所述CRISPR-Cas9系统或所述打靶载体转染细胞，获得的中靶阳性细胞克隆，即为Ano5基因敲除的细胞系。第五方面，本发明提供所述细胞系在制备Ano5基因敲除小鼠模型中的应用。第六方面，本发明提供一种Ano5基因敲除小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：1基于CRISPR-Cas9系统设计靶向动物Ano5基因的sgRNA；2sgRNA与Cas9核酸酶的mRNA经体外转录后，一起注射到小鼠受精卵中，然后将受精卵移植到假孕母鼠体内，产出F0代，对F0代进行PCR鉴定，将阳性F0代与野生型小鼠交配获得F1代杂合子，F1代杂合子进行杂交，筛选Ano5基因敲除的纯合子代，作为Ano5基因敲除小鼠模型。其中，用于PCR鉴定的特异性引物包括SEQIDNO:3-6：Ano5-F1：5’-AGAAATGCTGTTGTTTGCGGCTCTG-3’Ano5-R1：5’-ACCTCCGATGTCAGGGTCACAGATT-3’和Ano5-F2：5’-AGAAATGCTGTTGTTTGCGGCTCTG-3’Ano5-R2：5’-ACCTCCGATGTCAGGGTCACAGATT-3’其中，Ano5-F1和Ano5-R1对应的扩增产物大小为759bp，Ano5-F2和Ano5-R2对应的扩增产物大小为660bp。第七方面，本发明提供按照上述方法构建的Ano5基因敲除小鼠模型，模拟人类GDD疾病。第八方面，本发明提供上述小鼠模型在GDD疾病研究及其药物开发中的应用。本发明的目的可以采用以下的技术措施来进一步实现。1、建立Ano5基因敲除小鼠模型；2、鉴定小鼠Ano5基因敲除效率；3、通过影像学检查检测小鼠骨组织改变；4、用ELISA方法检测小鼠碱性磷酸酶和抗酒石酸酸性磷酸酶浓度；5、通过组织学方法验证骨组织改变；6、小鼠原代成骨细胞培养通过茜素红、ALP试验检测小鼠成骨能力；7、小鼠原代成骨细胞培养通过qPCR检测成骨细胞成骨相关因子的指标。借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：本发明提供了一种通过Ano5基因敲除小鼠动物模型模拟人GDD疾病的方法。利用CRISPR-Cas9基因敲除技术，敲除Ano5基因第11,12外显子。Ano5基因敲除后的小鼠均表现为胫骨皮质骨增厚，下颌骨肥大，血液中碱性磷酸酶含量升高等多种人GDD患者临床表现。本发明构建的模拟人GDD疾病的小鼠模型，该模型稳定性强稳定遗传，与人类GDD疾病表现类似，可为进一步研究GDD发病机制以及基因治疗提供经济、简单、可靠的动物模型。附图说明图1为本发明实施例1中构建的Ano5基因敲除小鼠模型模式图A，Ano5敲除和对照组小鼠基因型鉴定电泳图B以及验证Ano5基因敲除效率的qPCR图C。图2为本发明实施例1中Ano5基因敲除和对照组小鼠X线及microCT结果。其中，A表示Ano5基因敲除小鼠和对照组小鼠下颌骨、胫骨和股骨X线比较；B为microCT检测Ano5基因敲除小鼠和对照组小鼠下颌骨影像。图3为本发明实施例1中Ano5基因敲除和对照组小鼠血清成骨A、破骨B指标水平。图4为本发明实施例1中Ano5基因敲除和对照组小鼠下颌骨矢状面A、胫骨及股骨BHE染色行组织学检测。C-D图为高倍镜下Ano5基因敲除和对照组小鼠牙周膜改变，其中B为牙槽骨；D为牙本质；PDL为牙周膜；E：Ano5基因敲除和对照组小鼠牙周膜行白介素ⅥIL-6、肿瘤坏死因子TNF-α免疫组化染色结果。图5为本发明实施例1中Ano5基因敲除和对照组小鼠成骨细胞培养茜素红染色大体观察A和显微镜下观察B及Ca2+浓度C测定，Ano5基因敲除和对照组小鼠成骨细胞培养碱性磷酸酶水平检测结果D。图6为本发明实施例1中Ano5基因敲除和对照组小鼠成骨细胞相关成骨指标qPCR检测。其中，A-I分别表示骨一型胶原Col1α1；骨钙素Ocn；骨桥蛋白Opn；成骨相关转录因子Runx2；锌指结构转录因子SP7；骨保护素Opg；骨保护素核因子κB受体活化因子配体OpgRankl；Ano6基因。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册SambrookJ&RussellDW,MolecularCloning:aLaboratoryManual,2001，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1Ano5基因敲除小鼠模型的构建1、根据小鼠Ano5基因GenBank：NC_000073.6第11,12外显子序列，基于CRISPR-Cas9系统设计sgRNA；所述Ano5的sgRNA序列如下图1-A：第11外显子上的识别位点：5′-CCTGGGATGTTATCTGGCTTGC-3′第12外显子上的识别位点：5′-CCAGGGATGTGTGCACACTAGGC-3′2、PMSG处理C57BL6雌性小鼠3周龄，平均体重15g，46小时后注射hCG，与雄性小鼠合笼交配，次日取受精卵进行显微注射，将步骤1的sgRNA100ngml与Cas9核酸酶50ngml的mRNA经体外转录后，一起注射到受精卵中，取注射后存活的受精卵移植到假孕母鼠体内，产出小鼠，即F0代小鼠。3、提取F0代小鼠尾部DNA，PCR扩增产物测序，鉴定是否为嵌合体。4、待F0代雄性Founder小鼠7周龄，雌性小鼠4周龄，分别与野生型异性小鼠交配获得杂合子小鼠F1代，小鼠出生后20天进行PCR鉴定，若有阳性小鼠出生，则表示转基因已经整合到生殖细胞。5、将F1代杂合子小鼠杂交获得F2代纯合子小鼠Ano5--，即为小鼠动物模型。本发明选用F3代及以后获得稳定遗传性状的小鼠模型进行后续实验。①小鼠基因型鉴定PCR鉴定结果出现660bp和759bp两种带型图1-B，660bp为突变等位基因条带，759bp为野生型等位基因条带，两条条带同时出现表明小鼠同时携带野生型和突变型基因，即小鼠为杂合子Ano5+-小鼠。其中，用于PCR鉴定的特异性引物包括：Ano5-F1：5’-AGAAATGCTGTTGTTTGCGGCTCTG-3’Ano5-R1：5’-ACCTCCGATGTCAGGGTCACAGATT-3’Ano5-F2：5’-AGAAATGCTGTTGTTTGCGGCTCTG-3’Ano5-R2：5’-ACCTCCGATGTCAGGGTCACAGATT-3’其中，Ano5-F1和Ano5-R1对应的扩增产物大小为759bp，Ano5-F2和Ano5-R2对应的扩增产物大小为660bp。qPCR鉴定小鼠Ano5基因敲除效率，即基因敲除后小鼠Ano5基因qPCR表达量平均值与野生型小鼠Ano5基因qPCR表达量平均值之比，引物序列为：Ano5-F：5’-AATGCTGTTGTTTGCGGCTC-3’Ano5-R：5’-TCAAACAGATGGGAGAACTTTG-3’结果如图1-C所示，该结果表明，在肌肉和骨骼中，Ano5基因敲除效率均98％,即Ano5基因几乎完全被敲除。②小鼠X-ray及microCT检测取12周龄的小鼠下颌骨、胫骨及股骨，进行X-ray和microCT检测。X-ray曝光时间为0.125s，microCT分辨率参数为14μm，可见Ano5敲除组小鼠下颌骨骨量增加，骨小梁排列稀疏，胫骨弯曲，胫骨和股骨的皮质骨增厚图2。③小鼠血清碱性磷酸酶和抗酒石酸酸性磷酸酶检测利用眼球取血的方法采12周龄的小鼠全血，4℃静置1h后3000rpm离心5分钟提取血清。根据试剂盒说明书进行碱性磷酸酶及ELISA检测，可见Ano5敲除组小鼠碱性磷酸酶水平较对照组明显升高，但两者抗酒石酸酸性磷酸酶水平并无明显差别图3。④小鼠骨组织形态学检测取12周龄的小鼠下颌骨、胫骨及股骨，固定48h后脱钙，脱水，包埋，制备5μm的石蜡切片行HE染色，进一步证实影像学检查结果图4A-B。另外，在高倍显微镜下观察，Ano5基因敲除小鼠牙周膜可见血管数目增加图4-C，并出现类牙骨质样物质沉积图4-D及表现为牙周炎症图4-E。⑤Ano5敲除和对照组小鼠成骨细胞培养茜素红染色及Ca2+浓度测定及碱性磷酸酶检测取新生24h小鼠头盖骨放入装有1％浓度的青霉素10000IU链霉素10000μgml的PBS缓冲液中，0.3％I型胶原蛋白与0.05％胰蛋白酶按体积比1:1混合37℃消化4个循环，每循环35分钟，取第2-4循环细胞培养原代成骨细胞。待细胞传到2代，以2×105密度接种于六孔板内，铺板贴壁第2天更换成骨诱导培养基分别培养3、7、14、21天；取诱导0、3、5、7天的细胞行碱性磷酸酶水平检测；取7、14、21天细胞进行茜素红染色，可见Ano5敲除组小鼠碱性磷酸酶水平较对照组明显升高，矿化结节明显增多，成骨能力增强图5A-D。⑥Ano5敲除和对照组小鼠成骨细胞相关成骨指标qPCR检测小鼠原代成骨细胞培养0、3、7、14、21天，步骤同上，提取RNA进行实时荧光定量PCR检测成骨相关指标，表现出Ano5敲除组小鼠成骨能力明显增强图6A-I。Ano5敲除和对照组小鼠骨组织骨矿物质含量、骨矿物质密度比较见表1，Ano5敲除和对照组小鼠骨小梁情况比较见表2。表1microCT检测12周龄Ano5基因敲除小鼠及野生型小鼠骨矿物情况注：*P首都医科大学附属北京口腔医院Ano5基因敲除小鼠模型的构建方法KHP181118283.36SIPOSequenceListing1.0122DNA人工序列ArtificialSequence1cctgggatgttatctggcttgc22223DNA人工序列ArtificialSequence2ccagggatgtgtgcacactaggc23325DNA人工序列ArtificialSequence3agaaatgctgttgtttgcggctctg25425DNA人工序列ArtificialSequence4acctccgatgtcagggtcacagatt25525DNA人工序列ArtificialSequence5agaaatgctgttgtttgcggctctg25625DNA人工序列ArtificialSequence6acctccgatgtcagggtcacagatt25

权利要求：1.用于敲除小鼠Ano5基因的CRISPR-Cas9系统，其特征在于，所述CRISPR-Cas9系统中sgRNA作用位点位于Ano5基因的11和12号外显子上，sgRNA作用位点的DNA序列为5′-GCAAGCCAGATAACATCCCAGG-3′和5′-GCCTAGTGTGCACACATCCCTGG-3′。2.小鼠Ano5基因打靶载体，其特征在于，所述打靶载体是基于CRISPRCas9系统的sgRNA表达载体，sgRNA作用位点位于小鼠Ano5基因的11和12号外显子上，sgRNA作用位点的DNA序列为5′-CCTGGGATGTTATCTGGCTTGC-3′和5′-CCAGGGATGTGTGCACACTAGGC-3′。3.权利要求1所述CRISPR-Cas9系统或权利要求2所述打靶载体在制备Ano5基因敲除的细胞系中的应用。4.Ano5基因敲除的细胞系，其特征在于，用权利要求1所述CRISPR-Cas9系统或权利要求2所述打靶载体转染细胞，获得的中靶阳性细胞克隆，即为Ano5基因敲除的细胞系。5.权利要求4所述细胞系在制备Ano5基因敲除小鼠模型中的应用。6.Ano5基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1基于CRISPR-Cas9系统设计靶向Ano5基因的sgRNA；2sgRNA与Cas9核酸酶的mRNA经体外转录后，一起注射到小鼠受精卵中，然后将受精卵移植到假孕母鼠体内，产出F0代，对F0代进行PCR鉴定，将阳性F0代与野生型小鼠交配获得F1代杂合子，F1代杂合子进行杂交，筛选Ano5基因敲除的纯合子代，作为Ano5基因敲除小鼠模型；其中，sgRNA的定义同权利要求1中所述。7.根据权利要6所述的方法，其特征在于，用于PCR鉴定的特异性引物包括：Ano5-F1：5’-AGAAATGCTGTTGTTTGCGGCTCTG-3’Ano5-R1：5’-ACCTCCGATGTCAGGGTCACAGATT-3’和Ano5-F2：5’-AGAAATGCTGTTGTTTGCGGCTCTG-3’Ano5-R2：5’-ACCTCCGATGTCAGGGTCACAGATT-3’。

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