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申请/专利权人：北京大学

摘要：本发明公开了一种如通式I所示的2‑芳甲酰胺基噻吩‑3‑羧酸类化合物作为ANO1蛋白抑制剂的用途，其中，各取代基的定义详见说明书。此外，本发明还公开了该化合物的制备方法和包含其的药物组合物。本发明的芳甲酰胺基噻吩‑3‑羧酸类化合物具有ANO1蛋白抑制的药理学作用，具有镇痛或麻醉和肿瘤增殖抑制的药效学作用。

主权项：1.4,5-二甲基-2-4-叔丁基苯基甲酰胺基噻吩-3-羧酸或其盐在制备抑制结肠癌细胞增殖的药物中用途。

全文数据：2-芳甲酰胺基噻吩-3-羧酸类衍生物作为AN01蛋白抑制剂的用途及制备方法技术领域[0001]本发明属于医药技术领域，具体地说，涉及2-芳甲酰胺基噻吩-3-羧酸类化合物具有ANOlAnoctamin1，或TMEM16A蛋白抑制作用，可用于镇痛或麻醉相关药物开发。背景技术[0002]疼痛是除了血压、呼吸、脉搏和体温之外的第五生命体征，控制患者疼痛的重要性不言而喻，研究开发更加高效、副作用更小的止痛药物具有重大意义。[0003]除典型的中枢阿片受体镇痛药和非留体类解热镇痛药之外，目前临床上鲜有其他类型的镇痛药物。而上述二者在应用上又有各自的局限性。中枢镇痛药物，包括成瘾性、耐药性在内的多种不良反应广泛存在。外周解热镇痛药物也存在局限性。其一是胃肠道不良反应，例如环氧合酶COX选择性较差的阿司匹林及扑热息痛等;其二是由于选择性过高带来的心血管不良反应，例如C0X-2选择性抑制剂罗非昔布;另外，COX抑制剂对肾脏均有影响，主要包括钠、钾潴留，严重的引起急性肾衰竭、间质性肾炎等。[0004]除镇痛药物自身的应用局限之外，临床上还有很多疼痛类型无特效药。例如部分慢性疼痛和神经病理性疼痛，其具有痛感强烈、持续时间长等特点。在这些疼痛的治疗中，目前的两类镇痛药物远不能满足需求。[0005]f丐激活氯通道CalciumActivedChlorideChannel，CaCC作为人体阴离子通道，广泛分布于呼吸道、消化道等具有分泌功能的腺上皮细胞中，也存在于视网膜、背根神经节及平滑肌细胞中，参与多种细胞生理活动，例如分泌蛋白及盐的跨上皮转运、神经信号传导、动作电位复极、平滑肌收缩等。迄今为止，被发现的CaCC分子基础主要有CLCAChloridechannelaccessory、TweetyhTTHYlandhTTYH3、Bestrophins和Anoctamins0[0006]ANOlAnoctaminI，也被称为TMEM16ATransmembraneprotein16A，是一类具有八次跨膜结构的膜蛋白。ANOl最初被发现在部分肿瘤组织中特异性高表达，如胃肠道间质瘤、口腔鳞状细胞癌、头颈部鳞状细胞癌等，而在相同起源的正常组织低表达或不表达。2008年，ANOl蛋白首次被确认为CaCC的分子基础，在体外可表现完整的钙激活氯电流特征.[0007]已知ANO1特异性抑制剂主要有CaCCinh系列，TMEM16Ainh-A系列、MONNA系列、Ani9系列，和部分天然化合物，以上化合物普遍对于ANOl稳转系中的CaCC电流具有明显抑制作用，但在具有CaCC电生理特征的人体组织细胞中，抑制效果不一致;此外，以上抑制剂对于ANOl相关的肿瘤增殖抑制效果也存在差异，CaCCinh-AOl和天然产物TannicAcid具有明显抑制作用，而其余抑制剂则无效。[0010]目前已知的ANOl蛋白抑制剂[0011]ANOl在痛觉传导中扮演重要角色，其作为CaCC的分子基础如果被抑制，会导致神经信号传导效率大幅降低。通过此种方式，理论上可有效抑制相应传入神经对疼痛信号的传导作用，起到镇痛的效果。例如，ANOl高度表达于与痛觉相关的背根神经节DRG细胞中，在DRG中阻断或敲低ANOl蛋白，可显著降低小鼠在疼痛模型中的痛觉反应。此外，辣椒素引起的痛觉相关模型中，痛觉行为可以被ANOl抑制剂TMEM16Ainh-A01降低。[0012]ANOl蛋白ANOl抑制剂的镇痛机理区别于经典镇痛药物。从目前已知的研究报道来看，其主要通过ANOl蛋白的离子通道功能产生作用。神经细胞在静息状态时的膜电位呈现负值，细胞膜内电位低于细胞膜外电位;而产生神经冲动的过程中，膜电位上升，此过程主要通过阳离子内流阴离子外流实现。而ANOl作为钙激活氯离子通道，当其受到抑制后，无法将阴离子栗出细胞，从而难以实现膜电位的升高，产生神经冲动。当前有很多研究证实了这一理论:在对ANOl进行抑制或沉默之后，实验动物对疼痛刺激的敏感程度显著下降。在生理性疼痛的热板实验、针刺实验和辣椒素、福尔马林、角叉菜胶诱导的炎性疼痛中，ANOl抑制剂均有明显的镇痛作用。但是，由于缺少高效的ANOl蛋白抑制剂分子，上述研究还并不完备，特别是对于ANOl抑制剂镇痛过程中的详细机理及其与上下游通路之间的关系，目前的研究还有待进一步深化。[0013]综上，ANOl蛋白抑制剂能够有效抑制f丐激活氣通道的生理功能，可以在疼痛治疗中发挥重要作用;ANOl蛋白作为已报道的唯一一个外周阴离子通道镇痛靶点，具有较大新颖性;除此之外，ANOl蛋白还具有其他功能，在许多疾病的治疗中也有着巨大潜力。发明内容[0014]本发明人研发了一种2-芳甲酰胺基噻吩-3-羧酸类衍生物，该系列衍生物具有显著抑制ANOl蛋白活性的药理学作用，同时具有抑制钙激活氯离子通道的药理学作用，还具有镇痛的药效学作用。[0015]本发明的目的是提供一种2-芳甲酰胺基噻吩-3-羧酸类化合物作为ANOl蛋白抑制剂的用途。[0016]本发明的第二目的是提供一种新型的2-芳甲酰胺基噻吩-3-羧酸类化合物。[0017]本发明的第三个目的是提供上述化合物的制备方法。[0018]本发明的第四个目的是提供包含上述化合物的药物组合物。[0019]具体地说，本发明提供了一种如通式⑴所示的2-芳甲酰胺基噻吩-3-羧酸类化合物，或其在药学上可接受的立体异构体、前药、盐、溶剂化物或者水合物，作为ANOl蛋白抑制剂的用途：[0021]其中，心选自：氢、未取代的CI-C4烷基、取代的苯基、未取代的萘基或取代的萘基，这里，所述的取代的苯基是指苯环上的一个或多个氢被下列基团所取代:未取代的C1-C4烷基、卤代的Cl-C4烷基、未取代的Cl-C4烷氧基、卤代的Cl-C4烷氧基、苯基、或卤素；[0022]R2选自：氢、未取代的C1-C4烷基；[0023]或者RjPR2形成下列结构：[0025]这里，R3和R4各自独立地选自氢、未取代的C1-C4烷基;RdPR6各自独立地选自氢、未取代的C1-C4烷基、或未取代的C1-C4烷氧基；[0026]Ar选自未取代的苯基或取代的苯基、未取代的萘基或取代的萘基、未取代的噻吩基或取代的噻吩基，这里，所述的取代的苯基是指苯环上的一个或多个氢被下列基团所取代:未取代的CI-C4烷基、卤代的CI-C4烷基、未取代的CI-C4烷氧基、卤代的CI-C4烷氧基、或卤素;所述的取代的萘基是指萘环上的一个或多个氢被下列基团所取代:未取代的C1-C4烷基、卤代的CI-C4烷基、未取代的CI-C4烷氧基、卤代的CI-C4烷氧基、或卤素;所述的取代的噻吩基是指噻吩环上的一个或多个氢被下列基团所取代:未取代的C1-C4烷基、卤代的Cl-C4烷基、未取代的Cl-C4烷氧基、卤代的Cl-C4烷氧基、或卤素。[0027]在本发明的实施方案中，所述的ANOl抑制剂的用途，包括ANOl抑制相关的镇痛、麻醉、治疗哮喘、治疗痢疾、抑制肿瘤细胞增殖和迀移等。[0028]在本发明优选的实施方案中，本发明提供的一种如通式⑴所示的2-芳甲酰胺基噻吩-3-羧酸类化合物作为ANOl蛋白抑制剂的用途，其中，Ri为:4-甲氧基苯基、4-三氟甲基苯基、4_叔丁基苯基、α-蔡基、β-蔡基、4_苯基苯基、4_氣苯基、4_氣苯基、或2，4_二氣苯基；[0029]办选自：氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、或叔丁基。[0030]在本发明优选的实施方案中，本发明提供的一种如通式⑴所示的2-芳甲酰胺基噻吩-3-羧酸类化合物作为ANOl蛋白抑制剂的用途，其中，RjPR2形成下列结构：[0032]这里，R3和R4各自独立地选自氢、或甲基;RdPR6各自独立地选自氢、甲基、或甲氧基。[0033]在本发明优选的实施方案中，本发明提供的一种如通式⑴所示的2-芳甲酰胺基噻吩-3-羧酸类化合物作为ANOl蛋白抑制剂的用途，其中，Ar选自4-甲苯基、4-叔丁基苯基、4-甲氧基苯基、α-萘基、β-萘基、2,4-二氯苯基、2-噻吩基、或4-甲基-1-萘基。[0034]在本发明特别优选的实施方案中，本发明提供的一种如通式（1所示的2-芳甲酰胺基噻吩-3-羧酸类化合物作为ANOl蛋白抑制剂的用途，所述化合物选自下列化合物：[0035]2-4-叔丁基苯基甲酰氨基-4-4-甲氧基苯基噻吩-3-羧酸；[0036]2-噻吩-2-甲酰氨基-4-4-甲氧基苯基_噻吩-3-羧酸；[0037]2-4-叔丁基苯基甲酰氨基-4-4-三氟甲基苯基噻吩-3-羧酸；[0038]2-4-叔丁基苯基甲酰氨基-4-4-氯苯基噻吩-3-羧酸；[0039]2-4-叔丁基苯基甲酰氨基-4-4-叔丁基苯基噻吩-3-羧酸；[0040]2-4-甲氧基苯基甲酰氨基-4-4-叔丁基苯基噻吩-3-羧酸；[0041]2-2-萘基甲酰氨基-4-4-叔丁基苯基噻吩-3-羧酸；[0042]2-4-叔丁基苯基甲酰氨基-4-4-氟苯基噻吩-3-羧酸；[0043]2-4-叔丁基苯基甲酰氨基-4-4-苯基苯基噻吩-3-羧酸；[0044]2-4-叔丁基苯基甲酰氨基-4-2，4-二氯苯基噻吩-3-羧酸；[0045]2-1-萘基甲酰氨基-4-4-氯苯基噻吩-3-羧酸；[0046]2-2-萘基甲酰氨基-4-4-氯苯基噻吩-3-羧酸；[0047]2-2，4-二氯苯基甲酰氨基-4-4-氯苯基噻吩-3-羧酸；[0048]2-噻吩-2-甲酰氨基-4-4-氯苯基噻吩-3-羧酸；[0049]2-4-甲基-1-萘基）甲酰氨基-4-4-氯苯基噻吩-3-羧酸；[0050]2-4-叔丁基苯甲酰氨基-8Η-茚并[2，Ι-b]噻吩-3-羧酸；[0051]2-4-叔丁基苯甲酰氨基-8，8-二甲基-茚并[2，I-b]噻吩-3-羧酸；[0052]2-4-叔丁基苯甲酰氨基-5-甲氧基-8H-茚并[2,1-b]噻吩-3-羧酸；[0053]2-4-叔丁基苯甲酰氨基-6-甲氧基-8H-茚并[2,1-b]噻吩-3-羧酸；[0054]2-噻吩-2-甲酰氨基-8-氢-茚并[2，卜b]噻吩-3-羧酸；[0055]2-α-萘基甲酰氨基-8-氢-茚并[2,卜b]噻吩-3-羧酸；[0056]2-2-萘基甲酰氨基-8-氢-茚并[2,1-b]噻吩-3-羧酸；[0057]4，5-二甲基-2-4-叔丁基苯基甲酰胺基噻吩-3-羧酸；[0058]4,5-二甲基-2-4-甲基-1-萘基）甲酰胺基噻吩-3-羧酸；[0059]4,5-二甲基-2-1-萘基甲酰胺基噻吩-3-羧酸；[0060]4,5-二甲基-2-4-甲基苯基甲酰胺基噻吩-3-羧酸；[0061]4,5-二甲基-2-3-溴苯基甲酰胺基噻吩-3-羧酸；[0062]4-甲基-5-丙基-2-4-甲基苯基甲酰胺基噻吩-3-羧酸；[0063]5-甲基-2-4-甲基苯基甲酰胺基噻吩-3-羧酸；[0064]2-4-叔丁基苯基甲酰氨基-4-2-萘基噻吩-3-羧酸；[0065]或其药学上可接受的立体异构体、前药、盐、溶剂化物、或者水合物。[0066]另一方面，本发明提供了一种新型的如通式（1所示的2-芳甲酰胺基噻吩-3-羧酸类化合物，或其在药学上可接受的立体异构体、前药、盐、溶剂化物或者水合物：[0068]其中，RjPR2形成下列结构：[0070]这里，R3和R4各自独立地选自氢、未取代的Cl-C4烷基;RdPR6各自独立地选自氢、未取代的C1-C4烷基、或未取代的C1-C4烷氧基；[0071]Ar选自未取代的苯基或取代的苯基、未取代的萘基或取代的萘基、未取代的噻吩基或取代的噻吩基，这里，所述的取代的苯基是指苯环上的一个或多个氢被下列基团所取代:未取代的CI-C4烷基、卤代的CI-C4烷基、未取代的CI-C4烷氧基、卤代的CI-C4烷氧基、或卤素;所述的取代的萘基是指萘环上的一个或多个氢被下列基团所取代:未取代的C1-C4烷基、卤代的CI-C4烷基、未取代的CI-C4烷氧基、卤代的CI-C4烷氧基、或卤素;所述的取代的噻吩基是指噻吩环上的一个或多个氢被下列基团所取代:未取代的C1-C4烷基、卤代的Cl-C4烷基、未取代的Cl-C4烷氧基、卤代的Cl-C4烷氧基、或卤素；[0072]或者如通式⑴所示的2-芳甲酰胺基噻吩-3-羧酸类化合物选自下列化合物：[0073]2-4-叔丁基苯基甲酰氨基-4-4-三氟甲基苯基噻吩-3-羧酸；[0074]2-4-叔丁基苯基甲酰氨基-4-4-叔丁基苯基噻吩-3-羧酸；[0075]2-4-甲氧基苯基甲酰氨基-4-4-叔丁基苯基噻吩-3-羧酸；[0076]2-4-叔丁基苯甲酰氨基-4-2-萘基噻吩-3-羧酸；[0077]2-4-叔丁基苯基甲酰氨基-4-4-苯基苯基噻吩-3-羧酸；[0078]2-4-叔丁基苯基甲酰氨基-4-2，4-二氯苯基噻吩-3-羧酸；[0079]2-2，4-二氯苯基甲酰氨基-4-4-氯苯基噻吩-3-羧酸；[0080]2-噻吩-2-甲酰氨基-4-4-氯苯基噻吩-3-羧酸；[0081]2-4-甲基-1-萘基）甲酰氨基-4-4-氯苯基噻吩-3-羧酸；[0082]4,5-二甲基-2-4-甲基-1-萘基）甲酰胺基噻吩-3-羧酸；[0083]4,5_二甲基-2-1-萘基甲酰胺基噻吩-3-羧酸。[0084]在本发明的优选实施方案中，本发明提供的一种新型的2-芳甲酰胺基噻吩-3-羧酸类化合物，选自下列化合物：[0085]2-4-叔丁基苯甲酰氨基-8H-茚并[2，1-b]噻吩-3-羧酸；[0086]2-4-叔丁基苯甲酰氨基-8，8-二甲基-茚并[2，Ι-b]噻吩-3-羧酸；[0087]2-4-叔丁基苯甲酰氨基-5-甲氧基-8H-茚并[2,1-b]噻吩-3-羧酸；[0088]2-4-叔丁基苯甲酰氨基-6-甲氧基-8H-茚并[2,1-b]噻吩-3-羧酸；[0089]2-噻吩-2-甲酰氨基-8-氢-茚并[2，Ι-b]噻吩-3-羧酸；[0090]2-α-萘基甲酰氨基-8-氢-茚并[2,卜b]噻吩-3-羧酸；[0091]2-2-萘基甲酰氨基-8-氢-茚并[2,Ι-b]噻吩-3-羧酸；[0092]或其在药学上可接受的立体异构体、前药、盐、溶剂化物或者水合物。[0093]在本发明的实施方案中，所述化合物的药学上可接受的盐，例如与无机碱或有机碱形成无毒性碱加成盐，例子包括:钠盐、钾盐、镁盐等。[0094]为避免歧义，除非另有说明，术语“取代”表示被一个或多个限定的基团取代。在基团可选自许多可选基团的情况下，这些选择的基团可以相同或不同。[0095]第三方面，本发明还提供了如通式⑴所示的2-芳甲酰胺基噻吩-3-羧酸化合物的制备方法，包括如下步骤：[0096]1式II所示酰卤化合物与式III化合物反应，得到式IV化合物；[0098]2式IV所示化合物水解反应，得到式⑴化合物；[0100]这里，所述式（II、（III或（IV中取代基R^RdPAr的定义如上述的式（I化合物所定义的;办选自未取代的C1-C4烷基、或苄基;X为氯、溴或碘。[0101]在本申请的优选实施方案中，本发明提供的如通式⑴所示的2-芳甲酰胺基噻吩_3-羧酸化合物的制备方法，在涉及茚并[2，Ι-b]噻吩类化合物时，其制备方法包括：[0103]其中，各式中取代基的定义如上面的定义。[0104]第四方面，本发明提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包括药理学上有效量的本发明2-芳甲酰胺基噻吩-3-羧酸类化合物和一种药学上可接受的载体。所述的化合物与药物赋形剂和或稀释剂混合，即可得到本发明的药物组合物。该药物组合物可以片剂、胶囊、丸剂、粉末、颗粒剂、散剂、或糖浆剂的形式□服给药，或以注射剂的形式非胃肠给药。所述药物组合物的单位剂量为〇.Img至Ig。[0105]上述药物组合物可通过常规制药方法制备。合适的药物载体包括惰性稀释剂或填料、水和各种有机溶剂。可用的药物辅助剂包括调味剂、粘合剂、赋形剂等。常用的赋形剂包括:糖类衍生物、淀粉衍生物、纤维素衍生物、阿拉伯胶等;粘合剂例如明胶、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇；崩解剂例如羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮；润滑剂例如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、鲸蜡等;稳定剂例如对羟基苯甲酸甲酯;还有各种增甜剂或调味剂、色素或染料以及稀释剂例如水、乙醇、丙二醇、甘油等。[0106]本发明的有益效果体现为:本发明的化合物是一种新的化合物且具有ANOl蛋白抑制活性，可用作ANOl蛋白抑制剂，从而能够用于多种与ANOl蛋白有关系的疾病治疗，例如镇痛麻醉、治疗哮喘、治疗痢疾、抑制肿瘤细胞增殖和迀移等;另外，本发明的化合物提供药物用途优势，例如在其作用机制、结合、抑制活性、安全性分布、溶解性或者生物利用度中的一个或多个方面。[0107]经实验证明，本发明提供的2-芳甲酰胺基噻吩-3-羧酸类化合物在功能性实验中表现出对ANOl蛋白的高亲和力和高抑制活性。其中用稳定表达ANOl的FRT细胞进行对ANOl蛋白抑制活性功能性试验。在该实验中，本发明的化合物IC5Q在30μΜ至400nM之间。[0108]因此，本发明提供的2-芳甲酰胺基噻吩-3-羧酸类化合物可用于治疗多种与ANOl蛋白相关疾病，如镇痛麻醉、治疗哮喘、治疗痢疾、抑制肿瘤细胞增殖和迀移等。附图说明[0109]图1表示的是本发明化合物YX-285全细胞膜片钳实验结果。[0110]图2表示的是本发明化合物YX-4全细胞膜片钳实验结果。[0111]图3表示的是本发明化合物YX-285和YX-4对人类结肠癌细胞HT-29的增殖抑制活性。具体实施方式[0112]以下举例用于进一步说明本发明，不以任何形式构成对本发明的限制。[0113]本发明中，缩写为：[0114]ANOlAnoctaminl蛋白[0115]FRT细胞Fisher大鼠甲状腺滤泡上皮细胞[0116]ATP三磷酸腺苷[0117]CaCC钙激活氯离子通道[0118]IC5Q半数抑制量[0119]核磁数据由BrukerAvance111400型核磁共振仪测定，内标为TMStertramethylsilance;核磁数据由mestReNovaVer.6.1.0，mesrelabResearchS.L.软件处理;高分辨质谱数据ESI-TOF由BrukerApexIVFTMS型傅里叶离子回旋变换质谱测定;薄层层析硅胶板上海上邦实业有限公司）；柱层析硅胶200-300目，上海上邦实业有限公司）。[0120]所有溶剂、原料和试剂如无说明均为市售分析纯。[0121]合成方法一：[0123]其中，各取代基的定义详见实施例。[0124]dl.氰基乙酸乙酯（1.2eq.，吗啉（2.2eq.，乙酸（leq.，乙醇，65°C，3小时，氩气保护；[0125]d2.硫粉1.2eq.，分三次加入，每次反应10-12小时，65°C，氩气保护；[0126]b.芳酰氯缓慢滴加（1.2eq.，三乙胺（leq.，二氯甲烷，TC;滴加完成后室温反应8小时；[0127]c.Na0H5eq.，H20,甲醇，1'册，65。：，8小时。[0128]此合成方法以加热作为反应条件，是经典的Gewald反应方法。引入乙酸与吗啡啉形成离子体系，可显著提高反应活性。反应分为两个阶段，首先不加硫粉，进行Knoevenage1反应，生成α、β不饱和酮，而后分批加入硫粉进行环合生成目标中间体。反应时间较长，产率随酮α位C亲核进攻能力提升而提升。反应过程中需要进行氩气保护，目的是减少体系中吗啡啉等有机碱被氧化变黑，减小处理难度。[0129]d2步骤结束后的后处理可采用“酸提碱沉”法进行。首先向反应液中加入二氯甲烷稀释，而后盐水洗涤四遍，过短硅胶柱去除TLC基线杂质和残留的水，而后旋干。加入新置酸性乙酸乙酯将噻吩氨基变成铵盐从有机相中沉淀出来。取沉淀置于瓶中，加入稀释的氨水充分中和，而后加入二氯甲烷萃取，洗涤水相三次，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥，过滤旋干即得纯净产物。[0130]合成方法二：[0132]el.氰基乙酸乙酯，乙酸铵（1.2eq.，乙酸（1.2eq，甲苯，回流，12小时；[0133]62.硫粉（1.269.，吗啉（1.2〇9.，乙醇，80°：，36-48小时；[0134]b.芳酰氯缓慢滴加（1.2eq.，三乙胺（1，二氯甲烷，TC;滴加完成后室温反应8小时；[0135]c.Na0H5eq.，H2〇,甲醇，THF，65°C，8小时[0136]合成方法二是针对反应性特别低的芳香酮类如2H茚酮类底物），该类型底物在合成方法一的条件下不反应，主要是由于第一步类似Knoevenagel反应的亲核进攻步骤反应性较低。因此采用降低溶剂剂型和提高温度的方法促进亲核进攻发生。首先使用甲苯体系进行110度左右回流，促进Knoevenagel反应进行，而后旋干体系，更换溶剂为乙醇，再分次加入硫粉进行反应。反应液呈现黑色，TLC基线附近有大量杂质，可能是由于过高的反应温度导致副产物增加，同时高温时有机碱加速氧化。该反应后处理较为耗时，反应液呈黑色粘稠状，首先加入二氯甲烷稀释，而后盐水洗涤四遍，有机相浓缩后使用柱色谱粗分离，去除基线黑色杂质，而后再使用柱色谱分离，即可得到纯净产物，部分化合物也可使用合成方法二中的酸提碱沉法进行分离。[0137]实施例1[0138]化合物1[0140]合成方法：[0141]利用“合成方法一”合成。第一步：取IL圆底烧瓶，加入对三氟甲基苯乙酮12.038g64mmol，氛基乙酸乙酯10·848g76·8mmol，乙酸I·920g76·8mmol，吗啡琳8·8g76.8mmoI，乙醇500ml为溶剂，氩气保护，65°C反应三小时，而后分三次共加入硫粉3.072g76.8mmo1反应30-36小时。加入250ml二氯甲烷稀释，300ml盐水洗涤四遍，取有机相过短硅胶柱去除基线杂质和残留水。旋干后加入新置酸性乙酸乙酯至固体大量析出，静置结晶过夜，过滤时固体使用石油醚淋洗三遍，烘干固体后加入稀释200ml氨水充分摇匀，加入200ml二氯甲烷萃取，洗涤水相三次，合并有机相使用无水硫酸钠干燥，旋干即得无色片状晶体2-氨基-4-对三氟甲基苯基-噻吩-3-羧酸15.336g48.64mmol，产率76%;第二步:取第一步产物0.230g0.73mmol，1-呋喃甲酰氯0.086g，0°C滴加完毕后室温反应8小时，二氯甲烷石油醚重结晶，得到白淡黄色粉末2-4-叔丁基苯基甲酰氨基-4-4-三氟甲基苯基）噻吩-3-羧酸乙酯0.257g0.54mmol，产率75%;第三步：取第二步产物0.107g0.34mmol，NaOH0.068g1.7mmol，四氢呋喃、甲醇、水混合溶剂（1:3:3，室温反应8小时，加入乙酸调节pH至中性后，加入水重结晶，得到白粉末2-4-叔丁基苯基甲酰氨基Ια-三氟甲基苯基噻吩-3-羧酸0.103g0.23mmol，S卩1号化合物。产率43.1%[0142]1HMMR400MHz，DMS0Sl2.51s，lH，7.93d，J=8.0Hz，2H，7.72dd，J=21.2，8·0Ηζ，4Η，7.62d，J=7.8Hz，2H，7.09s，lH，1.36s,9H.13C匪R101MHz，DMS0S167.37,163.51，156.53,150.08,142.06,138.67,130.34,129.66,127.52,126.61，124·72，117·29，112·94,35·35,31·27·HRMSESI-T0F+mzC17H13N04S2[M-1]—理论值：446.471;实测值：446.1041;[0143]实施例2[0144]化合物2[0146]合成方法同1号化合物，总产率:35.2%。[0147]1HMMR400MHz，DMS0Sl2.47s，lH，7.93d，J=7.9Hz，2H，7.69d，J=7.9Hz，2H,7.40d，J=7.8Hz，2H,7.32d，J=7.8Hz，2H,6.92s，lH,1.36s，9H,1.34s,9H·13CNMR101MHz，DMSOδ167·74，163·40，156·44，149·87，149·64，140·15，134·88，129.76,129.20,127.48，126.57,124.65,116.00,112.84,35.32,34.69,31.64，31·27·HRMSESI-TOF+mzC26H29N03S[M-l]—理论值:434·58;实测值:434·1793;[0148]实施例3[0149]化合物3[0151]合成方法同1号化合物，总产率:36.4%。[0152]1HMMR400MHz，DMS0Sl2.44s，lH，7.95d，J=8.2Hz，2H，7.40d，J=7.6Hz，2H,7.32d,J=7.9Hz,2H,7.21d,J=8.2Hz,2H,6.91s,1H,3.90s,3H,1.34s,9H.13C匪R101MHz，DMS0δ167·77,163.34,163.02,150.05,149.62,140.10,134.91，129.59,129.19,124.65,124.56,115.85,115.04,112.64,56.08,34.70,31.64.HRMSESI-TOF+mzC23H23N04S[M-l]—理论值:408·499;实测值:408·1268;[0153]实施例4[0154]化合物4[0156]合成方法同1号化合物，总产率:40.2%。[0157]1HNMR400MHz,DMS0512.47s,lH,8.01-7.87m,6H,7.71d,J=7.9Hz,2H,7.56s，3H,7.09s，lH,1.37s，9H.13CNMR101MHz,DMSOδ167.65,163.50,156.50，150.01，140.11，135.57,133.06,132.50,129.74,128.60,128.30,127.88,127.51，127.43,126.83,126.62,126.52,126.36,116.63,113.00,35.36,31.29.HRMSESI-TOF+mzC26H23N03S[M-l]—理论值:428.533;实测值:428.1321;[0158]实施例5[0159]化合物5[0161]合成方法同1号化合物，总产率:30.1%。[0162]1HMMR400MHz，DMS0Sl2.44s，lH，7.93d，J=7.5Hz，2H，7.72dd，J=17.5，8·1Ηζ，6Η,7.51dd，J=17.2,7·9Ηζ，4Η,7.41t，J=7.2Hz,1H,7.02s，lH,1.37s，9H.13C匪R101MHz，DMS0δ167·64，163.49,156.52,149.95,140.33,139.77,139.18，136.93,130.10,129.73，129.44,127.88,127.50,127.03,126.61,126.19,116.37，112·87，35·35，31·28·HRMSESI-TOF+mzC28H25N03S[M-l]—理论值：454·570;实测值：454.1477；[0163]实施例6[0164]化合物6[0166]合成方法同1号化合物，总产率:22.1%。[0167]4^^40010^,01^037.921,1=7.1^,211,7.6811,1=19.8,9.0^,4¾,7.39d，J=8.IHz，1H，7·10s，lH，1.37s，9H.13CNMRHIMHz,DMS0δ167·28,163.52，156.53,150.01，138.49,137.47,131.40，130.48,130.14,130.00,129.97,129.70，127.51,126.62,117.27,112.98,35.36,31.29.HRMSESI-TOF+mzC22H19C12N03S[M-1]—理论值:447·363;实测值:446·0378;[0168]实施例7[0169]化合物7[0171]合成方法同1号化合物，总产率:45.4%。[0172]=8.3Hz，2H，7.70dt,J=14.7,7.0Hz,2H，7.44s，4H，7.02s,1H.13C匪R101MHz，DMSO5167.49,163.59,149.62,139.02,136.75,135.19,132.67,132.16,131.36,129.91,129.67,129.46,128.98,128.69，128.24,127.84,127.75,123.55,116.57,113.81.HRMSESI-TOF+mzC22H14C1N03S[M-l]—理论值:406·870;实测值:406·0304;[0173]实施例8[0174]化合物8[0176]合成方法同1号化合物，总产率:42.9%。[0177]4^^4001^,01^0312.078,111,7.888,211,7.671,1=8.3^,111,7.42dd,J=20.3,7.6Hz,4H,7.08s,lH.13CNMR101MHz,DMSO5166.70,162.51,148.18,138.87,137.15,136.46,132.63,132.29，132.07,131.95,131.24,130.51，128.55，127·93，117·18，114·21·HRMSESI-TOF+mzC18H10C13N03S[M-l]—理论值：425·701;实测值：425.9335;[0178]实施例9[0179]化合物9[0181]合成方法同1号化合物，总产率:36.3%。[0182]4^^4001^,01^0512.408,111,8.051,1=4.8^,111,7.818,111,7.42q,J=8.1Hz,4H,7.35t,J=3.7Hz,1H,7.00s,lH.13CNMR10IMHz,DMSO5167.39,158.49,149.49,138.83,137.07,136.54,134.02,132.25,131.32,130.43,129.29，127·87，116·75，113·01·HRMSESI-TOF+mzC18H21N02S1[M-l]—理论值：362·833;实测值：361.9715;[0183]实施例10[0184]化合物10[0186]合成方法同1号化合物，总产率:38.7%。[0187]1HNMR400MHz,DMS0512.08s,1H,8.51s,1H,8.20s,1H,7.91d,J=6.8Hz,lH,7.72s,2H,7.58d,J=6.4Hz,1H,7.43d,J=8.8Hz,4H,7.07s,lH,2.79s,3H.13CNMR101MHz,DMS05167.10,165.79,149.49,139.54,138.82,136.64,132.87,132.25,131.30,130.25,130.15,127.91,127.82,127.23,126.50,126.25,125.88，125.24,116.73,113.22，19.92.HRMSESI-TOF+mzC23H16C1N03S[M-l]—理论值：420.897;实测值：420.0451;[0188]实施例11[0189]化合物11[0191]合成方法：[0192]按照“合成方法二”合成。[0193]la2-氨基-8H-茚并[2，Ι-b]噻吩-3-甲酸乙酯[0194]将2,3_二氢茚酮（12.672g，96mmol、氰基乙酸乙酯（16.224g、醋酸铵（8.832g、乙酸5.760g加到甲苯500ml中，控制体系氩气保护，回流反应12小时。反应完成后，旋转蒸发溶剂，加入乙醇（500ml，吗啡啉9.984g硫粉4.608g，控制体系氩气保护，75-80摄氏度反应36-40小时，反应完成后，体系冷却至室温。向体系中加入二氯甲烷（300ml稀释，转移至萃取漏斗中，加入水（300ml，充分振摇后，弃水相保留有机相。使用盐水300ml，洗涤三遍，弃水相保留有机相，过短硅胶柱，取有机相旋转蒸发去除溶剂。加入乙酸乙酯，充分溶解，而后加入新置酸性乙酸乙酯，析出大量沉淀，体系变粘稠。静止过夜，过滤后保留滤渣，滤液旋转蒸发后，重复前述酸性乙酸乙酯析出沉淀过程。将滤渣转移至萃取漏斗内，加入稀释后的氨水300ml，充分振摇。而后加入二氯甲烷（300ml，振摇静置后，取有机相，水相使用二氯甲烷洗涤三遍，合并有机相，旋转蒸发后即得纯净2-氨基-8H-茚并[2，l-b]噻吩-3-羧酸乙酯。[0195]Ib2-4-叔丁基苯甲酰氨基-8H-茚并[2,1-b]噻吩-3-甲酸乙酯[0196]将2-氨基-8H-茚并[2，1-13]噻吩-3-羧酸乙酯（25911^，1111111〇1至于圆底烧瓶中，加入二氯甲烷30ml，加入三乙胺2.59ml，降温至0度。而后向烧瓶内缓慢滴加4-叔丁基苯甲酰氯（196mg，Immol的二氯甲烧溶液，滴加完成后恢复体系温度至室温，反应8小时。反应完成后，旋转蒸发溶剂，加入热二氯甲烷溶液至刚好溶解，加入石油醚进行重结晶，得到纯净产物2-4-叔丁基苯甲酰氨基-8H-茚并[2，Ι-b]噻吩-3-甲酸乙酯。[0197]Ic2-4-叔丁基苯甲酰氨基-8H-茚并[2,Ι-b]噻吩-3-羧酸[0198]取2-4-叔丁基苯甲酰氨基-8H-茚并[2,Ι-b]噻吩-3-甲酸乙酯（362mg，lmmol至于圆底烧瓶中，加入四氢咲喃（10，乙醇（15，水（15。将Na0H115mg，5mmol溶于水中，加入烧瓶。65摄氏度反应8小时。反应完成后滴加乙酸至中性，加入水，大量析出沉淀，静置过夜。过滤沉淀，烘干后溶于热二氯甲烷溶液中，加入石油醚重结晶，即得纯净2-4-叔丁基苯甲酰氨基-8H-茚并[2，Ι-b]噻吩-3-羧酸，即11号化合物。[0199]1HMMR400MHz，DMS0Sl2.48s，lH，8.25d，J=7.7Hz，lH，7.84d，J=7.9Hz，2H,7.60d,J=8.0Hz,2H,7.46d,J=7.3Hz,1H,7.28t,J=7.5Hz,1H,7.17d,J=7.4Hz,lH,3.80s,2H,1.29s,9H.13CNMR101MHz,DMS05167.80,163.17,156.38,152.32,147.03,140.72,138.97,136.13,129.68,127.45,126.90,126.53,125.13，124·84，122·63，107·92，35·32，34·50，31·26·HRMSESI-TOF+mzC23H21N03S[M-l]—理论值：390.484;实测值：390.1165;[0200]实施例12[0201]化合物12[0203]合成方法同11号化合物，总产率:22.7%。[0204]1HMMR400MHz，DMS0Sl2.56s，lH，8.26d，J=7.5Hz，lH，7.93d，J=7.7Hz，2H,7.69d,J=6.7Hz,2H,7.54d,J=7.IHz,1H,7.30dt,J=26.0,7.OHz,2H,1.52s,6H,1.36s,9H.13CNMR101MHz,DMSO5167.80,163.22,157.01,156.45,151.83,147.54,136.85,136.70，129.76,127.48,127.28,126.60,125.79,122.81，122.33，108·15，35·34，31·28，27·46·HRMSESI-TOF+mzC25H25N03S[M-l]—理论值：418·537;实测值:418.1468;[0205]实施例13[0206]化合物13[0208]合成方法同11号化合物，总产率:25.7%。[0209]1HMMR400MHz，DMS0Sl2.48s，lH，8.15d，J=8.6Hz，lH，7.89d，J=8.0Hz，2H,7.66d,J=8.0Hz,2H,7.14s,lH,6.90d,J=8.5Ηζ,ΙΗ,3.82s,2H,3.78s,3H，1.34s，9H.13C匪R101MHz,DMSOδ167·83,163.11,157.78,156.39,152.01,148.98,140.63,133.79,131.98，129.74,127.44,126.57,123.09,112.43,111.21，107.74.55.67.35.34.34.65,31.29.HRMSESI-TOF+mzC24H23N04S[M-l]—理论值：420.51;实测值:420.1263;[0210]实施例14[0211]化合物14[0213]合成方法同11号化合物，总产率:23.2%。[0214]1HMMR400MHz，DMS0Sl2.48s，lH，8.15d，J=8.6Hz，lH，7.89d，J=8.0Hz，2H,7.66d,J=8.0Hz,2H,7.14s,lH,6.90d,J=8.5Ηζ,ΙΗ,3.82s,2H,3.78s,3H，1.34s，9H.13C匪R101MHz,DMSOδ167·83,163.11,157.78,156.39,152.01,148.98,140.63,133.79,131.98，129.74,127.44,126.57,123.09,112.43,111.21，107.74.55.67.35.34.34.65,31.29.HRMSESI-TOF+mzC24H23N04S[M-l]—理论值：420.51;实测值:420.1263;[0215]实施例15[0216]化合物15[0218]合成方法同11号化合物，总产率:26.8%。[0219]1H匪R400MHz，DMS0S8.35s，lH，8.05d，J=4.6Hz，lH，7.81s，lH，7.55d，J=6.7Hz，lH,7.36s，2H,7.25d，J=7.IHz，1H，3.90s，2H.13C匪R101MHz，DMSO5167.75,158.24,151.76,147.00,140.82,138.96,137.22,136.19,133.88,130.27,129.25,126.90,125.16，124.84,122.67,108.30,34.56.HRMSESI-T0F+mzCl7H11N03S2[M-l]—理论值：340·399;实测值：340·0104;[0220]实施例16[0221]化合物16[0223]合成方法同11号化合物，总产率:21.7%。[0224]1HMMR400MHz，DMS0Sl2.28s，lH，8.52d，J=7.9Hz，lH，8.34d，J=7.6Hz，1H,8.20d,J=8.1Hz,lH,8.05dd,J=25.0,7.IHz,2H,7.68t,J=7.5Hz,3H,7.53d,J=7.1Hz,lH,7.35t,J=7.3Hz,lH,7.24t,J=7.IHz,1H,3.88s,2H.13CNMR101MHz，DMS0δ167.47，165.31，151.68,147.06,140.83,138.99,136.27,133.91,132.57,131.72，130.17,129.06,128.12,127.22,126.91，126.74,125.60,125.41，125·16，124·85，122·69，108·55，34·51·HRMSESI-TOF+mzC23H15N03S[M-l]—理论值：384·436;实测值：384·0685;[0225]实施例17[0226]化合物17[0228]合成方法同11号化合物，总产率:29.6%。[0229]4^^4001^,01^0512.708,111,8.588,111,8.321,1=7.51^,111,8.14s,2H,8.02dd,J=28.5,7.8Hz,2H,7.69t,J=7.IHz,2H,7.52d,J=7.OHz,1H,7.35t，J=7·2Ηζ，1Η,7.23t，J=7·0Ηζ，1Η,3.87s，2H.13C匪R101MHz，DMSOδ167.81，163.29,152.24,147.03，140.76,138.94,136.31，135.16,132.64,129.70，129.65,129.43,128.97，128.72,128.23,127.74,126.91，125.16,124.85,123.38，122·63，108·12，34·52.HRMSESI-TOF+mzC23H15N03S[M-l]—理论值：385·436;实测值：384.0694；[0230]实施例18[0231]化合物18[0233]合成方法同1号化合物，总产率:45.2%。[0234]1HNMR400MHz,DMS0512.09s,lH,8.47s,1H,8.16s,1H,7.83d,J=8.8Ηζ,1Η,7.68s,2H,7.51d,J=8.9Hz,1H,2.74d,J=15.5Hz,3H,2.31d,J=15.5Hz，6H.13C匪R101MHz，DMS0S167.85,165.16,145.86,139.27,132.82,130.39,130.24,129.76,127.68,127.14,126.22,125.86,125.16,123.26,114.39,19.89,14.44,12·53·HRMSESI-TOF+mzC19H17N03S[M-l]—理论值：338·408;实测值：338·0844;[0235]利用“合成方法二”合成。第一步:取IL圆底烧瓶，加入丁酮4.608g64mmol，氰基乙酸乙酯10.848876.8!111]1〇1，乙酸1.920876.81111]1〇1，吗啡琳8.8876.81111]1〇1，乙醇5001111为溶剂，氩气保护，68°C反应三小时，而后分三次共加入硫粉3.072g76.8mmol反应36-48小时。加入250ml二氯甲烷稀释，300ml盐水洗涤四遍，取有机相过短硅胶柱去除基线杂质和残留水。旋干后加入新置酸性乙酸乙酯至固体大量析出，静置结晶过夜，过滤时固体使用石油醚淋洗三遍，烘干固体后加入稀释200ml氨水充分摇匀，加入200ml二氯甲烷萃取，洗涤水相三次，合并有机相使用无水硫酸钠干燥，旋干即得无色片状晶体9.693g48.64mmol，产率76%;第二步、第三步同CaCCinh-AOl,略。终产物为无色片状晶体，总产率43.1%。[0236]实施例19[0237]化合物19[0239]合成方法同1号化合物，总产率:43.4%。[0240]1HMMR400MHz，DMS0Sl2.09s，lH，8.42d，J=7.8Hz，lH，8.22d，J=8.1Hz，1H,8.10d,J=7.6Hz,lH,7.96d,J=6.9Hz,1H,7.81-7.59m,3H,2.32d,J=18.8Hz，6H.13C匪R101MHz，DMS0S167.79,165.07,145.68,133.87,132.40,132.06,130.09,129.83,129.08，128.10,127.24,126.54,125.67,125.30,123.46,114.58,40.61，40·40，40·20，39·99，39·78，39·57，39·36，14·45，12·55·HRMSESI-TOF+mzC18H15N03S[M-l]—理论值：324·381;实测值：324·0693;[0241]试验例[0242]本发明中2-芳甲酰胺基噻吩-3-羧酸类衍生物对ANOl蛋白的抑制作用。[0243]本发明中药理活性进行了药理学和药效学两方面实验。药理学实验包括黄色荧光蛋白-碘离子荧光淬灭实验和全细胞膜片钳实验，共同证明本发明中2-芳甲酰胺基噻吩-3-羧酸类衍生物对ANOl蛋白的抑制作用。药效学实验包括镇痛实验和肿瘤细胞增殖抑制试验，镇痛实验为大鼠福尔马林诱导疼痛实验，共同证明本发明中2-芳甲酰胺基噻吩-3-羧酸类衍生物的镇痛药效作用和抑制肿瘤增殖的药效作用。[0244]黄色荧光蛋白-碘离子荧光淬灭实验如下：[0245]该方法使用ANOl蛋白和黄色荧光蛋白（YellowFluoresenceProtein，YFP共转染的FRT细胞。YFP的黄色荧光可以被碘离子淬灭。当细胞外液加入ATP时，细胞内钙库会释放I丐离子，使妈离子浓度升高，从而激活CaCCANOl通道。而CaCCANOl通道可以将细胞外碘离子转运进入细胞内部，因而在不加入调控剂时细胞内的YFP荧光会被淬灭，在酶标仪检测下，焚光值会显著降低。当加入CaCCANOl抑制剂时，焚光值降低的速度会减慢;反之，当加入激动剂时，荧光值降低速度会加快，通过比较荧光值的下降速率，可间接评价调控剂的活性。[0246]本发明中提供的部分化合物在黄色荧光蛋白-碘离子荧光淬灭实验中的活性数据：[0252]以上数据证明了本发明提供的2-芳甲酰胺基噻吩-3-羧酸类衍生物对ANOl蛋白的抑制作用。[0253]全细胞膜片钳实验如下：[0254]膜片钳实验被称为离子通道研究领域的“金标准”。全细胞膜片钳使用特制的中空玻璃电极吸住并吸破细胞表面，使细胞膜和电极之间形成封闭回路，电极可检测全细胞膜的离子转运电流。通过中空电极向细胞内液中加入钙离子，激活ANO1通道。此时电极上外加梯度电压，检测电流变化情况。当细胞外液加入抑制剂后，通道闭合，电阻升高，在相同的梯度电压下，相比不加药的空白组离子转运电流降低;激动剂反之。由此可评估调控剂对离子通道的影响。[0255]本发明中提供的部分化合物全细胞膜片钳实验结果如图1-2所示，黑色实线为未加药时钙激活氯通道电生理特征曲线，黑色虚线为加入1〇μΜ下列化合物后钙激活氯通道电流曲线：[0256]YX-285，本发明提供的2-1-萘基甲酰氨基-4-4-氯苯基噻吩-3-羧酸；[0257]YX-4,本发明提供的4,5_二甲基-2-4-叔丁基苯基甲酰胺基噻吩-3-羧酸；[0259]实验表明本发明提供的芳甲酰胺基噻吩-3-羧酸类衍生物对ANOl蛋白的抑制作用。[0260]大鼠福尔马林诱导疼痛实验如下：[0261]福尔马林诱导的疼痛实验是评价外周镇痛药物的常见模型。将福尔马林注射于大鼠或小鼠后爪皮下引起一个持续的伤害性刺激，激发一种明显的、弥散的、长时间持续痛行为反应，即回缩或震摇以及舔咬注射足现象，可模拟人类损伤后疼痛的某些特征。福尔马林皮下注射引起伤害性反应，其持续痛反应是外周伤害部位源性的，非中枢敏化结果，外周机制是引起广泛的非伤害性和伤害性感受器损伤，而外周长时间自发放电增强是由损伤电流引起初级传入纤维膜去极化所致，足底注射福尔马林可使C纤维的放电频率增加，产生痛觉敏化现象。[0262]1一般症状观察：[0263]实验期间观察记录动物行为活动、外观体征等，一般在给福尔马林溶液后立即开始观察，每只动物观察60min。[0264]2鼠缩足行为的测定：[0265]人工观察造模后第1-2分钟、5-6分钟内的抬腿次数和10-60分钟之间以5分钟为时间段第1分钟的抬腿次数（即10-11，15-16,20-21，25-26，30-31，35-36,40-41，45-46,50-51，55-56,60-61。[0266]3试验步骤：[0267]将雄性SD大鼠按体重分层后随机分组，每组10只，分别为阴性对照组、阳性对照组、模型组、受试化合物各剂量组。灌胃（皮下注射给予相应受试化合物，Ih0.5h后大鼠左后足底皮下注射5%的福尔马林50μ1造模，以形成皮丘为造模注射成功标准；阴性对照组灌胃给予生理盐水，Ih后大鼠左后足底皮下注射50μ1生理盐水，若注射足出血，则该只动物舍去不用。给予福尔马林溶液后立即开始观察，每只动物观察60min。[0268]4供试化合物[0269]普瑞巴林，治疗神经痛一线药物，阳性参照。[0270]YX-285,本发明提供的2-1-萘基甲酰氨基-4-4-氯苯基噻吩-3-羧酸；[0271]YX-4,本发明提供的4,5_二甲基-2-4-叔丁基苯基甲酰胺基噻吩-3-羧酸；[0272]5实验结果：[0275]注:*P〈0·05，**P〈0·OlVS模型组。[0276]经试验证明，本发明提供的4,5_二甲基-2-4-叔丁基苯基甲酰胺基噻吩-3-羧酸YX-4在20mgkg剂量下与镇痛阳性药物普瑞巴林40mgkg镇痛效应相当，具有明显的镇痛作用。以上实验证明本发明提供的2-芳甲酰胺基噻吩-3-羧酸类衍生物具有显著的镇痛作用。[0277]肿瘤细胞增殖抑制[0278]本发明采用CCK8试剂盒进行本发明提供的2-芳甲酰胺基噻吩-3-羧酸类衍生物对人类结肠癌细胞HT-29的增殖抑制活性检测。[0279]CellCountingKit简称CCK试剂盒，是一种基于WST-8化学名：2-2-甲氧基-4-硝苯基-3-4-硝苯基-5-2，4_二磺基苯-2H-四唑单钠盐的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。工作原理为:在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物formazan。颜色的深浅与细胞的增殖成正比，与细胞毒性成反比。使用酶标仪在450mM波长处测定OD值，间接反映活细胞数量。[0280]实验结果如下：[0281]给药后培养72小时，分别测定给药组和空白组吸光度OD。[0282]抑制率=ODssg-Oft；饑§ODssa[0283]注：**P〈〇·01;***P〈〇·001。11=3。[0284]YX-285号化合物为2-1-萘基甲酰氨基-4-4-氯苯基噻吩-3-羧酸；[0285]YX-4号化合物为4,5-二甲基-2-4-叔丁基苯基甲酰胺基噻吩-3-羧酸。[0286]以上实验表明本法名提供的2-芳甲酰胺基噻吩-3-羧酸类衍生物具有显著地抑制肿瘤细胞增殖的药理活性。

权利要求：1.一种如通式⑴所示的2-芳甲酰胺基噻吩-3-羧酸类化合物，或其在药学上可接受的立体异构体、前药、盐、溶剂化物或者水合物，作为ANOl蛋白抑制剂的用途：其中，心选自：氢、未取代的C1-C4烷基、取代的苯基、未取代的萘基或取代的萘基，这里，所述的取代的苯基是指苯环上的一个或多个氢被下列基团所取代:未取代的C1-C4烷基、卤代的Cl-C4烷基、未取代的Cl-C4烷氧基、卤代的Cl-C4烷氧基、苯基、或卤素；R2选自：氢、未取代的C1-C4烷基；或者RjPR2形成下列结构：这里，R3和R4各自独立地选自氢、未取代的C1-C4烷基;RdPR6各自独立地选自氢、未取代的C1-C4烷基、或未取代的C1-C4烷氧基；Ar选自未取代的苯基或取代的苯基、未取代的萘基或取代的萘基、未取代的噻吩基或取代的噻吩基，这里，所述的取代的苯基是指苯环上的一个或多个氢被下列基团所取代:未取代的CI-C4烷基、卤代的CI-C4烷基、未取代的CI-C4烷氧基、卤代的CI-C4烷氧基、或卤素；所述的取代的萘基是指萘环上的一个或多个氢被下列基团所取代:未取代的C1-C4烷基、卤代的C1-C4烷基、未取代的C1-C4烷氧基、卤代的C1-C4烷氧基、或卤素;所述的取代的噻吩基是指噻吩环上的一个或多个氢被下列基团所取代:未取代的C1-C4烷基、卤代的C1-C4烷基、未取代的C1-C4烷氧基、卤代的C1-C4烷氧基、或卤素。2.如权利要求1所述的用途，选自ANOl抑制相关的镇痛、麻醉、治疗哮喘、治疗痢疾、抑制肿瘤细胞增殖和迀移。3.如权利要求1所述的用途，其中，心为:4_甲氧基苯基、4-三氟甲基苯基、4-叔丁基苯基、α_蔡基、蔡基、4_苯基苯基、4_氣苯基、4_氣苯基、或2，4_二氣苯基；R2选自：氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、或叔丁基。4.如权利要求1所述的用途，其中，所述化合物选自：2-4-叔丁基苯基甲酰氨基-4-4-甲氧基苯基噻吩-3-羧酸；2-噻吩-2-甲酰氨基-4-4-甲氧基苯基-噻吩-3-羧酸；2-4-叔丁基苯基甲酰氨基-4-4-三氟甲基苯基噻吩-3-羧酸；2-4-叔丁基苯基甲酰氨基-4-4-氯苯基噻吩-3-羧酸；2-4-叔丁基苯基甲酰氨基-4-4-叔丁基苯基噻吩-3-羧酸；2-4-甲氧基苯基甲酰氨基-4-4-叔丁基苯基噻吩-3-羧酸；2-2-萘基甲酰氨基-4-4-叔丁基苯基噻吩-3-羧酸；2-4-叔丁基苯基甲酰氨基-4-4-氟苯基噻吩-3-羧酸；2-4-叔丁基苯基甲酰氨基-4-4-苯基苯基噻吩-3-羧酸；2-4-叔丁基苯基甲酰氨基-4-2,4-二氯苯基噻吩-3-羧酸；2-1-萘基甲酰氨基-4-4-氯苯基噻吩-3-羧酸；2-2-萘基甲酰氨基-4-4-氯苯基噻吩-3-羧酸；2-2，4-二氯苯基甲酰氨基-4-4-氯苯基噻吩-3-羧酸；2-噻吩-2-甲酰氨基-4-4-氯苯基噻吩-3-羧酸；2-4-甲基-1-萘基）甲酰氨基-4-4-氯苯基噻吩-3-羧酸；2-4-叔丁基苯甲酰氨基-8H-茚并[2，Ι-b]噻吩-3-羧酸；2-4-叔丁基苯甲酰氨基-8，8-二甲基-茚并[2，Ι-b]噻吩-3-羧酸；2-4-叔丁基苯甲酰氨基-5-甲氧基-8H-茚并[2，Ι-b]噻吩-3-羧酸；2-4-叔丁基苯甲酰氨基-6-甲氧基-8H-茚并[2，Ι-b]噻吩-3-羧酸；2-噻吩-2-甲酰氨基-8-氢-茚并[2，Ι-b]噻吩-3-羧酸；2-1-萘基甲酰氨基-8-氢-茚并[2，Ι-b]噻吩-3-羧酸；2-2-萘基甲酰氨基-8-氢-茚并[2，Ι-b]噻吩-3-羧酸；4，5-二甲基-2-4-叔丁基苯基甲酰胺基噻吩-3-羧酸；4，5-二甲基-2-4-甲基-1-萘基）甲酰胺基噻吩-3-羧酸；4，5-二甲基-2-1-萘基甲酰胺基噻吩-3-羧酸；4，5-二甲基-2-4-甲基苯基甲酰胺基噻吩-3-羧酸；4，5-二甲基-2-3-溴苯基甲酰胺基噻吩-3-羧酸；4-甲基-5-丙基-2-4-甲基苯基甲酰胺基噻吩-3-羧酸；5-甲基-2-4-甲基苯基甲酰胺基噻吩-3-羧酸；2-4-叔丁基苯基甲酰氨基-4-2-萘基噻吩-3-羧酸。5.—种新型的如通式⑴所示的2-芳甲酰胺基噻吩-3-羧酸类化合物，或其在药学上可接受的立体异构体、前药、盐、溶剂化物或者水合物：其中，RjPR2形成下列结构：这里，R3和R4各自独立地选自氢、未取代的C1-C4烷基;RdPR6各自独立地选自氢、未取代的C1-C4烷基、或未取代的C1-C4烷氧基；Ar选自未取代的苯基或取代的苯基、未取代的萘基或取代的萘基、未取代的噻吩基或取代的噻吩基，这里，所述的取代的苯基是指苯环上的一个或多个氢被下列基团所取代:未取代的CI-C4烷基、卤代的CI-C4烷基、未取代的CI-C4烷氧基、卤代的CI-C4烷氧基、或卤素；所述的取代的萘基基是指萘环上的一个或多个氢被下列基团所取代:未取代的C1-C4烷基、卤代的Cl-C4烷基、未取代的Cl-C4烷氧基、卤代的CI-C4烷氧基、或卤素;所述的取代的噻吩基是指噻吩环上的一个或多个氢被下列基团所取代:未取代的C1-C4烷基、卤代的C1-C4烷基、未取代的C1-C4烷氧基、卤代的C1-C4烷氧基、或卤素；或者如通式⑴所示的2-芳甲酰胺基噻吩-3-羧酸类化合物选自下列化合物：2-4-叔丁基苯基甲酰氨基-4-4-三氟甲基苯基噻吩-3-羧酸；2-4-叔丁基苯基甲酰氨基-4-4-叔丁基苯基噻吩-3-羧酸；2-4-甲氧基苯基甲酰氨基-4-4-叔丁基苯基噻吩-3-羧酸；2-4-叔丁基苯甲酰氨基-4-2-萘基噻吩-3-羧酸；2-4-叔丁基苯基甲酰氨基-4-4-苯基苯基噻吩-3-羧酸；2-4-叔丁基苯基甲酰氨基-4-2,4-二氯苯基噻吩-3-羧酸；2-2，4-二氯苯基甲酰氨基-4-4-氯苯基噻吩-3-羧酸；2-噻吩-2-甲酰氨基-4-4-氯苯基噻吩-3-羧酸；2-4-甲基-1-萘基）甲酰氨基-4-4-氯苯基噻吩-3-羧酸；4，5-二甲基-2-4-甲基-1-萘基）甲酰胺基噻吩-3-羧酸；4，5-二甲基-2-1-萘基甲酰胺基噻吩-3-羧酸。6.如权利要求5所述的化合物，选自下列化合物：2-4-叔丁基苯甲酰氨基-8H-茚并[2，1-b]噻吩-3-羧酸；2-4-叔丁基苯甲酰氨基-8，8-二甲基-茚并[2，Ι-b]噻吩-3-羧酸；2-4-叔丁基苯甲酰氨基-5-甲氧基-8H-茚并[2，Ι-b]噻吩-3-羧酸；2-4-叔丁基苯甲酰氨基-6-甲氧基-8H-茚并[2，Ι-b]噻吩-3-羧酸；2-噻吩-2-甲酰氨基-8-氢-茚并[2，Ι-b]噻吩-3-羧酸；2-1-萘基甲酰氨基-8-氢-茚并[2，Ι-b]噻吩-3-羧酸；2-2-萘基甲酰氨基-8-氢-茚并[2，Ι-b]噻吩-3-羧酸。7.包含权利要求5或6所述化合物的药物组合物。

百度查询： 北京大学 2-芳甲酰胺基噻吩-3-羧酸类衍生物作为ANO1蛋白抑制剂的用途及制备方法