申请/专利权人：西北农林科技大学

申请日：2019-03-12

公开（公告）日：2022-03-22

公开（公告）号：CN109735652B

主分类号：C12Q1/6895(20180101)

分类号：C12Q1/6895(20180101);C12N15/11(20060101)

优先权：

专利状态码：失效-未缴年费专利权终止

法律状态：2024.03.22#未缴年费专利权终止;2022.03.22#授权;2019.06.04#实质审查的生效;2019.05.10#公开

摘要：本发明属于小麦基因检测技术领域，特别涉及一种小麦抗条锈病主效应位点基因QYr.nwafu‑6BL.2的连锁KASP分子标记、引物及应用，该所述分子标记为分子标记KASP‑630和分子标记KASP‑162。本发明的两个分子标记的组合使用对条锈病主效位点QYr.nwafu‑6BL.2的预测准确率高达98％。

主权项：1.一种小麦抗条锈病基因QYr.nwafu-6BL.2的连锁KASP分子标记，其特征在于，所述分子标记为分子标记KASP-630和分子标记KASP-162；其中，分子标记KASP-630的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，为：5’-gagcgagtgaccgagcgtacacttacaaatgatgakggccgagttactggtgagacgtaggcatatccttg-3’，且核酸序列自5’端起第36位碱基是SNP位点，其中，k为g或t；分子标记KASP-162的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，为：5’-cattttgcttttccaaagttgacggatcgttgaaarttgtggattggaaagatgaaagatccacgatccgt-3’，且核酸序列自5’端起第36位碱基是SNP位点，其中，r为a或g。

全文数据：小麦抗条锈病基因QYr.nwafu-6BL.2的连锁KASP分子标记、引物及应用技术领域本发明属于小麦基因检测技术领域，特别涉及一种小麦抗条锈病基因QYr.nwafu-6BL.2的连锁KASP分子标记、引物及应用。背景技术小麦是我国最重要的粮食作物，保障小麦高产稳产既是人民生活基本需求的必然，也是维护国家和世界粮食安全的战略选择。影响小麦高产稳产因素有很多，其中环境大体分为生物胁迫和非生物胁迫，真菌病害是影响小麦生产安全的重要生物胁迫因素。小麦条锈病是世界性小麦病害，全球大多数小麦产区均有发生，中国是小麦条锈病发病面积最大，损失最严重的国家之一。小麦条锈病是由PucciniastriiformisWest.f.sp.triticiEriks.&Henn.条形柄锈菌小麦专化型，简称Pst导致的气传叶部病害。解放后，条锈病在我国发生了多次，且造成大量减产。进入本世纪以来，由于小麦条锈菌毒性变异和新小种产生，小麦条锈病已在我国小麦产区连续流行了近10年，每年损失小麦在上亿公斤，因此防治和控制该病害是一项长期任务。长期研究和实践证明利用抗病品种是防治小麦条锈病最为经济有效的重要措施。因而要确保我国粮食安全生产，实现病害持久控制，就必须开展挖掘和利用新的抗病基因，选育抗病品种，进行抗病基因合理布局稳定病菌群体结构，为病害持久控制策略的制定提供理论依据。优异的抗性来源是抗病育种的基础。目前我国小麦抗病品种利用所面临的突出问题是：小麦条锈病抗源较单一、匮乏；生产上大面积种植单一抗性基因的品种，使新毒性小种在寄主选择压力下很快发展为优势小种，导致品种抗病性“丧失”。利用与抗病基因连锁的分子标记培育抗病品种是控制小麦条锈病的有效措施。到目前为止，超过80个小麦抗条锈基因已经在普通小麦及其野生近缘属中被命名。但它们中的大多数至少在世界的某些地方已经失去抗病性。主效抗性基因，一般由单个基因就可提供近免疫的抗病性，而成株抗病性adultplantresistance,APR被认为是由多基因控制且有加性效应。由多个基因控制的数量性状位点与单个基因控制的抗病性相比，它的优势是抗性更持久。微效抗病基因通常对病原菌的作用方式会有一些变化，因此病原菌更难以克服其抗性。这些基因的抗病机制主要是抑制病菌生长，包括延长病菌潜育期，减少孢子堆的大小，减少侵染频率和降低孢子产量。因此，要解决小麦品种抗病性丧失的问题，首要任务是寻找有效新抗源、发掘新抗病基因，从而提高小麦生产品种抗病基因的多样性，培育并合理使用不同类型的抗病基因。明确小麦抗病基因的类型、位置和遗传机制是聚合成株抗性的基础，QTL定位可提供位点数目、在染色体上的位置及效应大小等重要信息，与其紧密连锁的分子标记可用于小麦抗病基因聚合。通过分子辅助选择可有目的地进行基因累加，从而实现抗源积累，提高抗病品种的使用年限。更为重要的是，应用分子标记能够在基因型水平上对作物种质资源进行深入评价和鉴定，同时把抗性与小麦其它重要农艺性状结合起来，大大缩短抗病育种的年限。国际玉米小麦改良中心CIMMYT长期致力于小麦抗病育种工作，其选育的多个小麦品种因其具有优良的抗性基因而被广泛应用在世界各地。从上世纪八十年代开始，我国陆续从CIMMYT种质小麦中转移、育成抗病优良小麦品种。CIMMYT小麦材料P10078经过多年多点的表型鉴定，其在中国具有良好的成株期抗性，经过基因定位发现其在小麦染色体6BL上可能含有新的抗条锈病基因QTL，暂命名为QYr.nwafu-6BL.2。开发与该抗条锈病位点的紧密连锁的SNP标记，对分子辅助多个抗病基因的聚合育种有重要意义。分子标记辅助抗病育种实践中，常采用表型分析、生化标记和基因标记鉴定相结合的方法。目前常用于基因型鉴定的分子标记有STS、SSR、SNP等，相比之下SNP标记可以利用芯片进行高通量自动化操作。Affymetrix公司开发的Wheat660KSNP芯片得到了很快的应用。LGCGenomics公司的研发的基于竞争性等位基因特异性PCRKompetitiveAllele-SpecificPCR，KASP技术的SNP基因分型检测方案，相比于传统的SNP检测方法，如酶切引物CAPS等，KASP可以通过通用荧光探针来无差别的连接目标引物，具有准确性高、通量灵活、操作价格低、平台兼容性好的特点。发明内容本发明的两个分子标记的组合使用对条锈病主效位点QYr.nwafu-6BL.2的预测准确率高达98％。本发明提供了一种小麦抗条锈病基因QYr.nwafu-6BL.2的连锁KASP分子标记，所述分子标记为分子标记KASP-630和分子标记KASP-162；其中，分子标记KASP-630的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，为：5’-gagcgagtgaccgagcgtacacttacaaatgatga[gt]ggccgagttactggtgagacgtaggcatatccttg-3’，且核酸序列自5’端起第36位碱基是SNP位点；分子标记KASP-162的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，为：5’-cattttgcttttccaaagttgacggatcgttgaaa[ag]ttgtggattggaaagatgaaagatccacgatccgt-3’，且核酸序列自5’端起第36位碱基是SNP位点。一种上述小麦抗条锈病基因QYr.nwafu-6BL.2的连锁KASP分子标记的PCR特异性扩增引物，分子标记KASP-630的引物包括：正向序列1：5’-gaaggtgaccaagttcatgctctcaccagtaactcggccc-3’，如SEQIDNO.3所示；正向序列2：5’-gaaggtcggagtcaacggattctcaccagtaactcggcca-3’，如SEQIDNO.4所示；反向序列3：5’-gagtgaccgagcgtacact-3’；如SEQIDNO.5所示；分子标记KASP-162的引物包括：正向序列4：5’-gaaggtgaccaagttcatgctatctttcatctttccaatccacaat-3’，如SEQIDNO.6所示；正向序列5：5’-gaaggtcggagtcaacggattatctttcatctttccaatccacaac-3’，如SEQIDNO.7所示；反向序列6：5’-ttccaaagttgacggatcgt-3’，如SEQIDNO.8所示。一种上述的小麦抗条锈病基因QYr.nwafu-6BL.2的连锁KASP分子标记在小麦抗条锈病基因定位或者检测或者小麦辅助育种中的应用。一种上述的小麦抗条锈病基因QYr.nwafu-6BL.2的连锁KASP分子标记的应用方法，包括以下步骤：S1，用常规方法提取待测材料的基因组DNA；S2，分别用分子标记KASP-630和分子标记KASP-162的引物组进行PCR扩增；其中，扩增体系均为：2.5μL的2×KASPV4.0Mastermix，0.056μL引物混合溶液，DNA模板为50-100ng，ddH2O补足5μL；每条正向引物浓度均为12mmolL，每条反向引物浓度均为30mmolL。扩增程序均为：94℃15min；94℃20s；61-55℃1min，且每个循环降0.6℃，10个循环；94℃20s、55℃60s、30个循环；S3，分别通过酶标仪使用FAMHEXROX光束扫描和KlusterCaller分型软件对PCR扩增产物进行分型检测；S4，采用分子标记KASP-630引物组的判断目标SNP的基因型；采用分子标记KASP-162引物组的判断目标SNP的基因型；S5，将S4中两个判断结果结合，若同时含有两种标记目标SNP“A-C”组合型，则待测小麦为候选的具有抗条锈病性状的小麦；其他情况待测小麦为候选的具有感条锈病性状的小麦；其中，所述两种标记KASP-630和KSAP-162的“A-C”组合型包括AA-CC、AA-CT、AC-CC和AC-CT四种组合。与现有技术相比，本发明的有益效果：本发明的两个分子标记定位的位点对该数量性状存在显著关联关系P小麦抗条锈病基因QYr.nwafu-6BL.2的连锁KASP分子标记、引物及应用2019-02-2112SIPOSequenceListing1.0171DNA人工合成1gagcgagtgaccgagcgtacacttacaaatgatga[gt]ggccgagttactggtgagacgtag61gcatatccttg72271DNA人工合成2cattttgcttttccaaagttgacggatcgttgaaa[ag]ttgtggattggaaagatgaaagat61ccacgatccgt72340DNA人工合成3gaaggtgaccaagttcatgctctcaccagtaactcggccc40440DNA人工合成4gaaggtcggagtcaacggattctcaccagtaactcggcca40519DNA人工合成5gagtgaccgagcgtacact19646DNA人工合成6gaaggtgaccaagttcatgctatctttcatctttccaatccacaat46746DNA人工合成7gaaggtcggagtcaacggattatctttcatctttccaatccacaac46820DNA人工合成8ttccaaagttgacggatcgt20921DNA人工合成9gaaggtgaccaagttcatgct211021DNA人工合成10gaaggtcggagtcaacggatt211121DNA人工合成11gaaggtgaccaagttcatgct211221DNA人工合成12gaaggtcggagtcaacggatt21

权利要求：1.一种小麦抗条锈病基因QYr.nwafu-6BL.2的连锁KASP分子标记，其特征在于，所述分子标记为分子标记KASP-630和分子标记KASP-162；其中，分子标记KASP-630的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，为：5’-gagcgagtgaccgagcgtacacttacaaatgatga[gt]ggccgagttactggtgagacgtaggcatatccttg-3’，且核酸序列自5’端起第36位碱基是SNP位点；分子标记KASP-162的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，为：5’-cattttgcttttccaaagttgacggatcgttgaaa[ag]ttgtggattggaaagatgaaagatccacgatccgt-3’，且核酸序列自5’端起第36位碱基是SNP位点。2.一种权利要求1所述的小麦抗条锈病基因QYr.nwafu-6BL.2的连锁KASP分子标记的PCR特异性扩增引物，其特征在于，分子标记KASP-630的引物包括：正向序列1：5’-gaaggtgaccaagttcatgctctcaccagtaactcggccc-3’，如SEQIDNO.3所示；正向序列2：5’-gaaggtcggagtcaacggattctcaccagtaactcggcca-3’，如SEQIDNO.4所示；反向序列3：5’-gagtgaccgagcgtacact-3’；如SEQIDNO.5所示；分子标记KASP-162的引物包括：正向序列4：5’-gaaggtgaccaagttcatgctatctttcatctttccaatccacaat-3’，如SEQIDNO.6所示；正向序列5：5’-gaaggtcggagtcaacggattatctttcatctttccaatccacaac-3’，如SEQIDNO.7所示；反向序列6：5’-ttccaaagttgacggatcgt-3’，如SEQIDNO.8所示。3.一种根据权利要求1所述的小麦抗条锈病基因QYr.nwafu-6BL.2的连锁KASP分子标记在小麦抗条锈病基因定位或者检测或者小麦辅助育种中的应用。4.一种如权利要求1所述的小麦抗条锈病基因QYr.nwafu-6BL.2的连锁KASP分子标记的应用方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，提取待测材料的基因组DNA；S2，分别用分子标记KASP-630和分子标记KASP-162的引物组进行PCR扩增；其中，扩增体系均为：2.5μL的2×KASPV4.0Mastermix，0.056μL引物混合溶液，DNA模板为50-100ng，ddH2O补足5μL；每条正向引物浓度均为12mmolL，每条反向引物浓度均为30mmolL；扩增程序均为：94℃15min；94℃20s；61-55℃1min，且每个循环降0.6℃，10个循环；94℃20s、55℃60s、30个循环；S3，分别通过酶标仪使用FAMHEXROX光束扫描和KlusterCaller分型软件对PCR扩增产物进行分型检测；S4，采用分子标记KASP-630引物组的判断目标SNP的基因型；采用分子标记KASP-162引物组的判断目标SNP的基因型；S5，将S4中两个判断结果结合，若同时含有两种标记目标SNP“A-C”组合型，则待测小麦为候选的具有抗条锈病性状的小麦；其他情况待测小麦为候选的具有感条锈病性状的小麦；其中，所述两种分子标记KASP-630和KSAP-162的“A-C”组合型包括AA-CC、AA-CT、AC-CC和AC-CT四种组合。

百度查询： 西北农林科技大学 小麦抗条锈病基因QYr.nwafu-6BL.2的连锁KASP分子标记、引物及应用

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