申请/专利权人：四川农业大学

申请日：2018-10-10

公开（公告）日：2019-02-12

公开（公告）号：CN109321671A

主分类号：C12Q1/6895(2018.01)I

分类号：C12Q1/6895(2018.01)I;C12N15/11(2006.01)I

优先权：

专利状态码：失效-发明专利申请公布后的撤回

法律状态：2019.03.12#发明专利申请公布后的撤回;2019.02.12#公开

摘要：本发明提供了小麦抗条锈病基因QYr.sicau‑1B‑1 SSR分子标记与应用。本发明提供了位于小麦1B染色体上的与小麦抗条锈病基因连锁的共显性分子标记Xwmc156。该分子标记Xwmc156与小麦1B上的抗条锈病QTL QYr.sicau‑1B‑1紧密连锁，可用来对小麦条锈病性状进行定位，从而在育种过程中淘汰对条锈病高感的植株，提高育种工作效率；还可用来检测小麦1B染色体上的抗条锈病QTL，快速筛选具有该位点的植株，进而方便进行高抗条锈病小麦的分子辅助育种，应用前景良好。

主权项：1.小麦抗条锈病基因QYr.sicau‑1B‑1SSR分子标记在鉴定小麦抗条锈病QTL QYr.sicau‑1B‑1中的应用，所述SSR分子标记为Xwmc156。

全文数据：小麦抗条锈病基因QYr.sicau-1B-1SSR分子标记与应用技术领域本发明分子生物学及作物遗传育种领域，特别是涉及与小麦抗条锈病性状相关的分子标记，具体地，涉及小麦抗条锈病基因QYr.sicau-1B-1连锁的SSR分子标记、扩增其的引物对以及该分子标记的应用。背景技术小麦是我国重要的粮食作物，常年种植面积在2000万公顷以上，约占粮食作物面积的27％；总产量为1亿吨以上，约占粮食作物产量的22％。小麦条锈病是我国小麦生产中一种重要的病害，当受到条锈菌的侵害时，小麦叶片会出现黄色的坏死斑，并且会产生黄色的夏孢子，这些孢子到后期就会变为黑色；条锈菌会造成叶片褪绿，无法进行光合作用，从而减产，严重时甚至会造成颗粒无收。一直以来国内外许多研究都在致力于新的抗性小麦品种的研究，其抗性基因的挖掘对选育和推广抗病品种具有重要的作用。小麦品系‘20828’在西南生态区近10余年一直对国内条锈病流行生理小种表现为近免疫抗性，其还具有小穗数多、株高适中和株型紧凑等特点，是育种首选亲本。分子标记辅助育种，不依赖于表型选择，即不受环境、基因互作、基因与环境互作等因素的影响，而是直接对基因型进行选择，因而能大大提高育种效率。简单重复序列simplesequencerepeats，SSR是一类广泛存在于基因组上的、由几个核苷酸重复单位组成的串联重复序列。由于去在基因组上的大量分布，多态性高，且操作技术简单，费用低廉，在分子辅助育种的已被广泛使用。小麦55KSNP芯片是在小麦66KSNP芯片的基础上开发的一款经济型中密度SNP芯片。芯片包含55,000个左右的小麦SNP标记，均匀分布在21条染色体上，每条染色体上平均有2,600个标记，标记间的平均遗传距离约为0.1cM，平均物理距离小于300Kb，适合于一般的种质资源多样性分析、遗传作图与新基因发掘、比较基因组分析、品种注册与鉴别指纹分析。因此，筛选出与抗条锈病基因紧密连锁的分子标记，利用分子标记对小麦抗条锈病基因进行选择，对选择小麦品种有着独特的优势。此前有学者对抗条锈病性状进行了QTL定位，发现与之相关的QTL在小麦中广泛存在，且分布在每一条染色体中，其中1B染色体上定位到的抗条锈病QTL最多。但是由于病原菌小种的高度变异，大量的抗条锈病基因已经或者正在丧失抗性，因此一直以来国内外许多研究都在致力于新的抗性小麦品种的研究，这就需要了解小麦抗源的抗病基因及其遗传特点，从而对小麦抗源进行更加合理有效的应用，培育出更高效的抗性品种。发明内容本发明的目的在于提供小麦抗条锈病基因QYr.sicau-1B-1SSR分子标记与应用，及扩增该分子标记的特异性引物对。本发明的目的是通过以下技术方案实现的：基于以上目的，申请人利用‘20828’为母本，以小麦品种川农16为父本杂交，得到杂种F1，F1代单株自交获得F2，在F2随机选取199个单株，进行自交，分别收获单株，下一年继续自交，如此重复直到F6代，获得含有199个系的重组自交系，构成遗传作图群体。对重组自交系群体条锈病表型鉴定，提取亲本‘20828’、川农16和重组自交系群体植株DNA，SNP标记分析多态性位点，筛选亲本之间多态性SSR标记，重组自交系群体SSR分析。根据SSR标记和SNP标记，利用JoinMap4.0构建遗传图谱。以LOD值3-10依次构建连锁群，寻找最优的标记数和标记顺序，确定连锁群及顺序。结合群体的条锈病表型数据定位抗条锈病基因QYr.sicau-1B-1，计算QYr.sicau-1B-1基因的位置和分子标记之间的遗传距离，发现‘20828’染色体1BL存在一个抗条锈病基因，最终得到10个多态性SSR标记，其中Xwmc156与抗条锈病基因QYr.sicau-1B-1紧密连锁。本发明提供的小麦抗条锈病基因QYr.sicau-1B-1SSR分子标记，所述分子标记为Xwmc156。该分子标记Xwmc156与小麦抗条锈病QTL位于小麦1B染色体长臂上，该标记与QTL之间紧密连锁。本发明还提供所述的分子标记Xwmc156在鉴定小麦抗条锈病QYr.sicau-1B-1中的应用。本发明的抗条锈病QTLQYr.sicau-1B-1来自‘20828’，该QTL位于小麦1B染色体长臂图1，表现为抗条锈病。本发明的小麦抗条锈病基因QYr.sicau-1B-1的分子标记Xwmc156由核苷酸序列如SEQIDNO.1～2所示的引物对PCR扩增获得。在抗条锈病性状的小麦种质品系中，该引物可扩增出大小为237bp的DNA片段。本发明提供了上述分子标记Xwmc156在作物分子辅助育种中的应用。本发明提供了上述分子标记Xwmc156在培育抗条锈病小麦中的应用。进一步地，所述的应用包括如下步骤：1提取待测植株的基因组DNA；2以待测植株的基因组DNA为模板，利用SEQIDNO.1～2所示的的引物，进行PCR扩增反应；3检测PCR扩增产物，若扩增产物大小为237bp的DNA片段，则待测植株为具有抗条锈病性状的小麦种质资源。本发明还提供了用于检测小麦抗条锈病基因QYr.sicau-1B-1的SSR分子标记Xwmc156的特异性引物对，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.1～2所示。本发明提供了上述特异性引物对在小麦种质资源改良中的应用。本发明提供了上述特异性引物对在小麦抗条锈病材料创制中的应用。含有上述特异性引物对的试剂盒也属于本发明的保护范围。本发明提供了一种鉴定小麦抗条锈病基因QYr.sicau-1B-1的分子标记方法，以待鉴定材料的DNA作为模板，用上、下游引物序列分别如SEQIDNO.1～2所示的特异性引物对其进行PCR扩增，PCR产物进行8％变性聚丙烯酰胺凝胶，若能扩增出237bp左右的片段，可判断为有抗条锈病基因QYr.sicau-1B-1的小麦。具体地，上述PCR扩增的扩增体系为：5μL10×PCR反应缓冲液、1.5UExTaqDNA聚合酶、2mMMgCl2、0.2mMdNTP、上、下游引物各150ng、100ng模板DNA、双蒸水加至总量为50μL。上述PCR扩增的程序：94℃预变性5min；94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸45s，总共35个循环；72℃延伸7min；PCR产物检测：PCR产物8％变性聚丙烯酰胺凝胶Acr:Bis＝19:1电泳检测PCR扩增产物，电泳分离，电极缓冲液为1×TBE，恒定功率60W，电压1500V；然后银染显色。本发明还提供用于鉴定抗条锈病性状的小麦种质资源的PCR检测试剂盒，所述检测试剂盒包含扩增所述分子标记Xwmc156的引物。本发明提供了含有扩增所述分子标记Xwmc156的引物的试剂盒在小麦质资源改良或小麦抗条锈病材料创制或小麦育种或鉴定抗条锈病小麦中的应用。本发明的有益效果在于：本发明公开了位于小麦1B染色体上的与小麦抗条锈病连锁的分子标记Xwmc156，该分子标记是小麦1B染色体长臂上抗条锈病QTLQYr.sicau-1B-1的侧翼标记共显性标记，连锁度高。该标记可用来检测小麦1B染色体上的抗条锈病QTL，快速筛选具有该位点的植株，进而方便进行高抗小麦的分子辅助育种。本发明提供的分子标记Xwmc156与小麦1B上的抗条锈病QTLQYr.sicau-1B-1紧密连锁，可用来对小麦抗条锈病这一性状进行定位，从而在育种过程中淘汰抗性较弱的植株，提高育种工作效率，并为小麦抗条锈病基因的研究提供基础。附图说明图1为小麦条锈病基因QYr.sicau-1B-1在1B染色体上的位置及与本发明分子标记Xwmc156之间的连锁遗传图谱。图2为‘20828’×川农16的重组自交系株系植株分子标记Xwmc156检测的电泳图谱；其中泳道1和2分别为‘20828’和川农16，泳道3、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、17、18、20、21、22为抗性株系，即扩增出了一条237bp左右的条带，泳道4、14、16、19、23、24为感病株系。图3为‘20828’×SY95-71的重组自交系株系植株分子标记Xwmc156检测的电泳图谱；其中，泳道1和2分别为SY95-71和‘20828’；泳道3、6、7、8、9、12、13、14、17、18、20为抗性株系，即扩增出了一条237bp左右的条带，泳道4、5、10、11、15、16、19为感病株系。具体实施方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。本发明实施例中所用的小麦种质资源均来自四川农业大学小麦研究所种质资源库。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1小麦抗条锈病基因QYr.sicau-1B-1及其分子标记Xwmc156的获得1利用‘20828’为母本，以小麦品种川农16为父本杂交，得到杂种F1，F1代单株自交获得F2，在F2随机选取199个单株，进行自交，分别收获单株，下一年继续自交，如此重复直到F6代，获得含有199个系的重组自交系，构成遗传作图群体。2重组自交系群体条锈病表型鉴定当诱发材料SY95-71充分发病后，田间记录供试材料的抗病性反应，反应型按照1-9级分类标准对群体中每一个株系进行判定，判定结果记为抗条锈病基因QYr.sicau-1B-1的形态标记数据。这样在连锁图上定位到的位置就是QYr.sicau-1B-1基因所在位置。3SSR分析以及SNP标记分析aDNA提取：用CTAB法提取亲本‘20828’、川农16和重组自交系群体植株DNA。bSNP标记分析由北京博奥晶典生物技术有限公司完成。亲本‘20828’的带型记为“a”，亲本川农16的带型记为“b”，群体材料中，带型来源于‘20828’的记为“a”，来源于川农16的记为“b”，缺失的记为“-”。c亲本之间多态性SSR标记筛选：选取GrainGeneshttp:wheat.pw.usda.govcgi-bingraingenes上公布的覆盖六倍体小麦A、B、D基因组的SSR引物，以‘20828’和川农16的DNA为模板，进行PCR扩增，共获得10对多态性SSR分子标记。d重组自交系群体SSR分析：以上步骤获得的多态性SSR标记为引物，利用每对引物同时扩增亲本‘20828’、川农16和重组自交系群体的DNA，进行基因型鉴定，获得分子标记数据。亲本‘20828’的带型记为“a”，川农16的带型记为“b”，群体材料中，带型来源于‘20828’的记为“a”来源于川农16的记为“b”。e连锁图谱的构建：根据SSR标记和SNP标记，利用JoinMap4.0构建遗传图谱。以LOD值3-10依次构建连锁群，寻找最优的标记数和标记顺序，确定连锁群及顺序。QTLIciMapping4.1中的完备区间作图法InclusiveCompositeIntervalMapping-ADD，ICIM-ADD，设置阀值LOD≥2.5的条件下，用2016-2018三年的条锈病疾病指数的数据来检测QTL，疾病指数＝[∑各级单株数×各级代表值调查总单株数×9]×100，数据越高表明越感病。最终在小麦1B染色体长臂上检测到抗条锈病QTL，且该QTL与标记Xwmc156紧密连锁图1。扩增标记Xwmc156的引物为：上游引物：5’-gcctctagggagaaaactaaca-3’SEQIDNo:1下游引物：5’-tcaagatcatatcctccccaac-3’SEQIDNo:2部分株系电泳结果见图2，其中19个植株具有与‘20828’相同的条带，6个植株具有与川农16相同的条带。表1‘20828’×川农16重组自交系Xwmc156标记扩增的电泳结果统计目标QTLQYr.sicau-1B-1在上述‘20828’×川农16的RIL群体中可解释16.32％～39.44％的表型变异。实施例2分子标记Xwmc156在鉴定抗条锈病QTLQYr.sicau-1B-1中的应用1利用‘20828’为母本，SY95-71为父本构建重组自交系，在后代株系中随机选择100个株系。2对所获得的100个株系进行Xwmc156标记检测，具体方法为：在苗期提取100个株系的DNA；以其为底物，以分子标记Xwmc156的特异性引物对为引物进行PCR扩增。PCR扩增体系：5μL10×PCRbuffer、1.5UExTaqTMDNA聚合酶、2mmollMgCl2、0.2mmolLdNTP、上下游引物各150ng，100ng模板DNA、双蒸水加至总量为50μL；PCR程序：94℃预变性5min；94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸45s，总共35个循环；72℃延伸7min；将得到的产物用8％的变性聚丙烯酰氨凝胶电泳分离，电极缓冲液为1×TBE，恒定功率60W，电压1500V；凝胶最后用硝酸银染色检测。电泳结果图3发现其中12个植株具有与‘20828’相同的条带，8个植株具有与SY95-71相同的条带。对比条锈病性状数据发现，株系条带类型与条锈病数据性状表型比较一致。表2‘20828’×SY95-71重组自交系Xwmc156电泳结果统计虽然，上文已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。序列表110四川农业大学120小麦抗条锈病基因QYr.sicau-1B-1SSR分子标记与应用130KHP181115919.61602170SIPOSequenceListing1.0210121122212DNA213人工序列ArtificialSequence4001gcctctagggagaaaactaaca22210221122212DNA213人工序列ArtificialSequence4002tcaagatcatatcctccccaac22

权利要求：1.小麦抗条锈病基因QYr.sicau-1B-1SSR分子标记在鉴定小麦抗条锈病QTLQYr.sicau-1B-1中的应用，所述SSR分子标记为Xwmc156。2.小麦抗条锈病基因QYr.sicau-1B-1SSR分子标记在筛选或鉴定抗条锈病性状的小麦种质资源中的应用，所述SSR分子标记为Xwmc156。3.小麦抗条锈病基因QYr.sicau-1B-1SSR分子标记在在作物分子辅助育种或在培育具有抗条锈病性的小麦中的应用，所述SSR分子标记为Xwmc156。4.如权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于，所述小麦抗条锈病基因QYr.sicau-1B-1SSR分子标记可通过如SEQIDNO.1～2所示的引物PCR扩增得到，PCR扩增后检测扩增产物，若扩增产物有大小为237bp的DNA片段，则待测植株为具有抗条锈病性状的小麦种质资源或有抗条锈病基因QYr.sicau-1B-1。5.用于检测小麦抗条锈病基因QYr.sicau-1B-1SSR分子标记Xwmc156的特异性引物对，其特征在于，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.1～2所示。6.含有权利要求5所述特异性引物对的试剂盒。7.权利要求5所述的特异性引物对或权利要求6所述的试剂盒在小麦种质资源改良中的应用。8.权利要求5所述的特异性引物对或权利要求6所述的试剂盒在小麦抗条锈病材料创制中的应用。9.权利要求5所述的特异性引物对或权利要求6所述的试剂盒在小麦育种中的应用。10.权利要求5所述的特异性引物对或权利要求6所述的试剂盒在鉴定抗条锈病小麦中的应用。

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