申请/专利权人：四川农业大学

申请日：2019-02-22

公开（公告）日：2022-04-05

公开（公告）号：CN109706263B

主分类号：C12Q1/6895(20180101)

分类号：C12Q1/6895(20180101);C12Q1/6851(20180101);C12N15/11(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2022.04.05#授权;2019.05.28#实质审查的生效;2019.05.03#公开

摘要：本发明属于分子育种技术领域，提供了与小麦抗条锈病基因QYr.sicau‑1B.1连锁的SNP分子标记及应用，所述SNP分子标记为KASP‑Yr，其可通过核苷酸序列如SEQIDNO.1～3所示的引物扩增得到。检测分析表明，该分子标记能准确跟踪所述小麦抗条锈病QTLQYr.sicau‑1B.1，预测小麦的抗条锈病特性，进而方便进行分子设计育种。本发明还公开了一种鉴定小麦抗条锈病QTLQYr.sicau‑1B.1的分子标记的方法，利用本发明所提供的方法能够加强抗条锈病预测的准确性，以便快速筛选出具有增加抗条锈病的小麦品种或品系用于育种，可大大加快小麦高产量品种的选育进程。

主权项：1.用于检测小麦抗条锈病的SNP分子标记的特异性引物组合，其特征在于，含有核苷酸序列如SEQIDNO.1~3所示的引物。

全文数据：与小麦抗条锈病基因QYr.sicau-1B-1连锁的SNP分子标记与应用技术领域本发明分子生物学及作物遗传育种领域，特别是涉及与小麦抗条锈病性状相关的分子标记，具体地，涉及小麦抗条锈病基因QYr.sicau-1B-1连锁的SNP分子标记、扩增其的引物对以及该分子标记的应用。背景技术小麦是我国重要的粮食作物，常年种植面积在2000万公顷以上，约占粮食作物面积的27％；总产量为1亿吨以上，约占粮食作物产量的22％。小麦条锈病是我国小麦生产中一种重要的病害，当受到条锈菌的侵害时，小麦叶片会出现黄色的坏死斑，并且会产生黄色的夏孢子，这些孢子到后期就会变为黑色；条锈菌会造成叶片褪绿，无法进行光合作用，从而减产，严重时甚至会造成颗粒无收。一直以来国内外许多研究都在致力于新的抗性小麦品种的研究，其抗性基因的挖掘对选育和推广抗病品种具有重要的作用。小麦品系‘20828’在西南生态区近10余年一直对国内条锈病流行生理小种表现为近免疫抗性，其还具有小穗数多、株高适中和株型紧凑等特点，是育种首选亲本。单核苷酸多态性SingleNucleotidePolymorphism，SNP指的是基因组内DNA某一特定核苷酸位置上存在转换、颠换、插入、缺失等变化而引起的DNA序列多态性。其技术是利用己知序列信息来比对寻找SNP位点，再利用发掘的变异位点设计特异性的引物来对基因组DNA或cDNA进行PCR扩增，得到基于SNP位点的特定的多态性产物，最后利用电泳技术分析产物的多态性。SNP标记的优点是数量多，分布广泛；在单个基因和整个基因组中分布不均匀；SNP等位基因频率容易估计。KASP是由LGC公司LaboratoryoftheGovernmentChemisthttp:www.lgcgenomics.com研发的竞争性等位基因特异性PCR技术KompetitiveAlleleSpecificPCR,KASP具有低成本、高通量特点的新型基因分型技术，通过引物末端碱基的特异匹配来对SNP以及InDel位点进行精准的双等位基因分型，在水稻、小麦、大豆等作物的分子标记辅助选择中得到广泛应用。此前有学者对抗条锈病性状进行了QTL定位，发现与之相关的QTL在小麦中广泛存在，且分布在每一条染色体中，其中1B染色体上定位到的抗条锈病QTL最多。但是由于病原菌小种的高度变异，大量的抗条锈病基因已经或者正在丧失抗性，因此一直以来国内外许多研究都在致力于新的抗性小麦品种的研究，这就需要了解小麦抗源的抗病基因及其遗传特点，从而对小麦抗源进行更加合理有效的应用，培育出更高效的抗性品种。发明内容本发明的目的在于提供与小麦抗条锈病QTLQYr.sicau-1B.1紧密连锁的分子标记。本发明的另一目的在于提供所述分子标记的荧光定量PCR引物。本发明的第三个目的在于提供上述小麦抗条锈病QTLQYr.sicau-1B.1紧密连锁的分子标记的应用。本发明的目的是通过以下技术方案实现的：基于以上目的，申请人利用抗条锈病小麦品系‘20828’为母本，以小麦品种‘CN16’为父本杂交，得到杂种F1，F1代单株自交获得F2，在F2使用单粒传法，一直到F8代，获得含有199个系的重组自交系，构成遗传作图群体。对重组自交系群体条锈病表型鉴定，提取亲本‘20828’、‘CN16’和重组自交系群体植株DNA，本研究使用小麦55KSNP芯片来定位小麦抗条锈病QTL。小麦55KSNP芯片是在小麦660KSNP芯片的基础上开发的一款经济型中密度SNP芯片。芯片包含55，000个左右的小麦SNP标记，均匀分布在21条染色体上，每条染色体上平均有2，600个标记，标记间的平均遗传距离约为0.1cM，平均物理距离小于300Kb，适合于一般的种质资源多样性分析、遗传作图与新基因发掘、比较基因组分析、品种注册与鉴别指纹分析。根据55KSNP芯片数据，利用JoinMap4.0构建遗传图谱。结合群体的条锈病表型数据，用QTLIciMapping4.0中的完备区间作图法InclusiveCompositeIntervalMapping-ADD，ICIM-ADD，设置阀值LOD≥2.5的条件下，用2016-2018三个年份共4个生态点及4个生态点条锈病的BLUP最佳线性无偏预测，bestlinearunbiasedprediction值来检测QTL，在1B染色体长臂上的1.3cM区间定位出稳定表达的小麦抗条锈病QTLQYr.sicau-1B.1，对侧翼标记进行物理定位并每隔1Mbp筛选位于区间内的基因，共筛选获得61个基因，并对这些基因在亲本‘20828’和‘CN16’进行克隆，对获得多态性位点并进行分子标记的开发，共设计了10对共30条KASP引物表1，最终得到标记KASP-Yr与抗条锈病QTLQYr.sicau-1B.1紧密连锁。表110对KASP引物序列本发明所述的小麦抗条锈病QTLQYr.sicau-1B.1，来自母本‘20828’，该QTL位于小麦染色体1B长臂上，在RefSeqv1.0基因组版本的物理位置为474Mb。本发明提供了上述小麦抗条锈病QTLQYr.sicau-1B.1在调控小麦抗条锈病性状中的应用。进一步地，本发明提供了小麦抗条锈病QTLQYr.sicau-1B.1的分子标记KASP-Yr，其与小麦抗条锈病QTLQYr.sicau-1B.1紧密连锁。该分子标记与小麦抗条锈病QTLQYr.sicau-1B.1共定位于小麦1B染色体长臂上，且与QYr.sicau-1B.1之间的遗传距离小于1.3cM。所述SNP分子标记的多态性为AG。含有该SNP分子标记的核苷酸序列如SEQIDNO.31所示。本发明的小麦抗条锈病QTLQYr.sicau-1B.1的分子标记KASP-Yr由核苷酸序列如SEQIDNO.1～3所示的引物对PCR扩增获得。上述3条引物包括2个上游引物和1条通用下游引物，所述2个上游引物5’端分别修饰不同的荧光基团；3条引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO.1、2和3所示。该SNP分子标记平均LOD值为21.39，解释约25.52％的表型变异。本发明提供了用于检测小麦抗条锈病QTLQYr.sicau-1B.1连锁的SNP分子标记的特异性引物组合，其含有核苷酸序列如SEQIDNO.1～3所示的引物。含有上述特异性引物组合的试剂盒属于本发明的保护范围。本发明提供了上述分子标记KASP-Yr、上述特异性引物组合、含有该特异性引物组合的试剂盒在小麦种质资源改良或在小麦抗条锈病材料创制或在小麦分子辅助育种中的应用中的应用。本发明提供了上述分子标记KASP-Yr、上述特异性引物组合、含有该特异性引物组合的试剂盒在鉴定抗条锈病小麦或培育抗条锈病性状的小麦中的应用。本发明提供了上述分子标记KASP-Yr、上述特异性引物组合、含有该特异性引物组合的试剂盒在鉴定小麦抗条锈病基因QYr.sicau-1B.1中的应用。本发明上述应用，具体为以待测植株样品的基因组DNA作为模板，用荧光定量PCR引物进行荧光定量PCR扩增，利用扩增结果进行基因型分型，将能够读取到引物SEQIDNO.2所修饰的荧光的植株鉴定为含有小麦抗条锈病QTLQYr.sicau-1B.1的植株。本发明提供了一种鉴定小麦抗条锈病QTLQYr.sicau-1B.1的分子标记方法，以待鉴定材料的DNA作为模板，用三条引物序列分别如SEQIDNO.1～3所示的特异性引物对进行PCR扩增并读取荧光值，若出现SEQIDNO.2所修饰的荧光，可判断为有抗条锈病QTLQYr.sicau-1B.1的小麦。具体地，上述的应用，包括如下步骤：1提取待测植株的基因组DNA；2以待测植株的基因组DNA为模板，利用扩增分子标记KASP-Yr的引物，在仪器CFX96Real-TimeSystem，进行PCR扩增反应并读取荧光值；3检测PCR扩增产物荧光，如果能够读取HEX荧光，则待测植株为具有抗条锈病性状的小麦资源。上述PCR扩增的扩增体系为：5μLMasterMix、三条引物SEQIDNo：1、2和3按照10ngμL的浓度，分别加入120μL，120μL和300μL并添加ddH2O460μL进行混合后作为混合引物使用，混合引物1.4μL、5ng模板DNA、双蒸水加至总量为10μL，同时需添加至少3个独立的以双蒸水代替DNA模板的空白。上述PCR扩增的程序为：94℃预变性15min；94℃变性20s、61℃复性延伸60s，共10个循环；94℃变性20s、55℃复性延伸60s，共26个循环；完成后进行荧光读值。本发明公开了位于小麦1B染色体上的与小麦抗条锈病连锁的分子标记KASP-Yr，该分子标记是小麦1B染色体长臂上抗条锈病QTLQYr.sicau-1B.1的侧翼标记，连锁度高。该标记可用来检测小麦1B染色体上的抗条锈病QTL，快速筛选具有该位点的植株，进而方便进行高抗小麦的分子辅助育种。本发明提供的分子标记KASP-Yr与小麦1B上的抗条锈病QTLQYr.sicau-1B.1紧密连锁，可用来对小麦抗条锈病这一性状进行定位，从而在育种过程中淘汰感病的植株，提高育种工作效率，并为小麦抗条锈病基因的研究提供基础。本发明首次公开了来自小麦‘20828’的抗条锈病QTLQYr.sicau-1B.1，位于小麦1B染色体长臂上，显著增加小麦抗条锈性。该QTL在小麦抗病性调控抗条锈性育种中具有较高的利用价值。本发明首次公开了基于荧光定量PCR平台精确检测小麦‘20828’的抗条锈病QTLQYr.sicau-1B.1的分子标记KASP-Yr，且为共显性标记，检测准确高效、扩增方便稳定。本发明公开的分子标记KASP-Yr与抗条锈病QTLQYr.sicau-1B.1极显著相关，呈现共分离标记特征，用于分子标记辅助选择的准确性高，提高适应不同环境的小麦抗条锈病品种的选择鉴定效率，且成功率高。附图说明图1为本发明实施例1中小麦抗条锈病QTLQYr.sicau-1B.1在1B染色体上的定位。图2为本发明实施例1中‘20828’בCN16’的重组自交系株系植株分子标记KASP-Yr检测的荧光读值结果；其中，HEX蓝色，‘20828’荧光为抗条锈病的株系，FAM橙色，‘CN16’荧光为感病株系；绿色荧光为杂合株系；黑色荧光为空白对照。图3为本发明实施例2中‘20828’×普通小麦品系‘SY95-71’的重组自交系株系植株分子标记KASP-Yr检测的荧光读值结果；其中，HEX蓝色，‘20828’荧光为抗条锈病的株系，FAM橙色，‘SY95-71’荧光为感病株系；绿色荧光为杂合株系；黑色荧光为空白对照。具体实施方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。本发明实施例中所用的小麦种质资源均来自四川农业大学小麦研究所种质资源库。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1小麦抗条锈病基因QYr.sicau-1B-1及其分子标记KASP-Yr的获得1利用小麦品系‘20828’为母本，以小麦品种‘CN16’为父本杂交，得到杂种F1，F1代单株自交获得F2，在F2使用单穗传法，一直到F8代，获得含有199个系的重组自交系，构成遗传作图群体。2重组自交系群体条锈病表型鉴定当诱发材料SY95-71充分发病后，田间记录供试材料的抗病性反应，反应型按照1-9级分类标准对群体中每一个株系进行判定，判定结果记为抗条锈病基因QYr.sicau-1B.1的形态标记数据。这样在连锁图上定位到的位置就是QYr.sicau-1B.1基因所在位置。355KSNP芯片分析aDNA提取：用CTAB法提取亲本‘20828’、‘CN16’和重组自交系群体植株DNA。b使用超微量分光光度计对提取的DNA进行质量检测，合格后送样至公司进行基因型分析，在本研究中双亲和作图群体的基因型分析由北京博奥晶典生物技术有限公司http:www.capitalbiotech.com与贾继增课题组合作开发的55KSNP芯片完成，该芯片可市售。c连锁图谱的构建：根据55KSNP芯片数据，利用JoinMap4.0构建遗传图谱。结合群体的条锈病表型数据，用QTLIciMapping4.0中的完备区间作图法InclusiveCompositeIntervalMapping-ADD，ICIM-ADD，设置阀值LOD≥2.5的条件下，用2016-2018三个年份共4个生态点及4个生态点条锈病的BLUP最佳线性无偏预测，bestlinearunbiasedprediction值来检测QTL，定位出小麦抗条锈病QTLQYr.sicau-1B.1，并计算QYr.sicau-1B.1的位置和分子标记之间的遗传距离。d遗传图谱的密化和紧密连锁分子标记的获得：为了密化遗传图谱并获得与抗条锈病QTLQYr.sicau-1B.1紧密连锁的分子标记，利用55KSNP芯片数据定位结果对侧翼标记进行物理定位并筛选位于区间内的基因，对这些基因在亲本‘20828’和‘CN16’进行克隆，对获得多态性位点并进行分子标记的开发，利用DNAMAN设计KASP引物共设计30条，10对KASP引物表1，最终得到标记KASP-Yr与抗条锈病QTLQYr.sicau-1B.1紧密连锁，该SNP分子标记平均LOD值为21.39，解释约25.52％的表型变异。e进行分析。设计的10对KASP引物中最终得到了1个分子标记与抗条锈病QTLQYr.sicau-1B.1紧密连锁。结果见图1，2。实施例2分子标记KASP-Yr在选择控制抗条锈病QTLQYr.sicau-1B.1上的应用1利用抗条锈病的普通小麦品系‘20828’为母本，感病的普通小麦品系‘SY95-71’为父本构建重组自交系，在后代株系中随机选择163个株系。2对所获得的163个株系进行KASP-Yr标记检测，具体方法为：提取163个株系的DNA；将其作为模板，以分子标记KASP-Yr的特异性引物对为引物进行PCR扩增并进行荧光读值，所述标记KASP-Yr引物为：FAM标签上引物：下划线部分为FAM标签序列5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCTTGTGTGTGACTGTACCATA-3’SEQIDNo.1HEX标签上引物：下滑线部分为HEX标签序列5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTTGTGTGTGACTGTACCATG-3’SEQIDNo.2通用下游引物：5’-CTGATACAGATAGGTAGCAT-3’SEQIDNo.3上述PCR扩增的扩增体系为：5μLMasterMix、三条引物SEQIDNo：1、2和3按照10ngμL的浓度，分别加入120μL，120μL和300μL并添加ddH2O460μL进行混合后作为混合引物使用，混合引物1.4μL、5ng模板DNA、双蒸水加至总量为10μL，同时需添加至少3个独立的以双蒸水代替DNA模板的空白。上述PCR扩增的程序为：94℃预变性15min；94℃变性20s、61℃复性延伸60s，共10个循环；94℃变性20s、55℃复性延伸60s，共26个循环；完成后进行荧光读值。荧光读值结果见图3，将检测到与‘20828’一致的HEX蓝色荧光的植株基因型记为A，为抗条锈病株系，同‘SY95-71’一样表现为FAM橙色荧光的植株基因型记为B，为感病型株系。各个株系基因型与4个生态点条锈病的BLUP值如表2所示。在标记KASP-Yr中与含有抗条锈病QTLQYr.sicau-1B.1的‘20828’类型相同的植株平均疾病指数为37.56，极显著低于与‘SY95-71’类型的植株疾病指数平均65.35。实际结果与预期结果一致，说明本发明的抗条锈病QTLQYr.sicau-1B.1确实有显著增高抗条锈病的作用；同时本发明的分子标记KASP-Yr可以用与跟踪鉴定抗条锈病QTLQYr.sicau-1B.1。表2‘20828’בSY95-71’重组自交系KASP-Yr基因型与表型对应结果虽然，上文已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。序列表四川农业大学与小麦抗条锈病基因QYr.sicau-1B-1连锁的SNP分子标记与应用KHP181115919.631SIPOSequenceListing1.0121DNA人工序列ArtificialSequence1cttgtgtgtgactgtaccata21221DNA人工序列ArtificialSequence2cttgtgtgtgactgtaccatg21320DNA人工序列ArtificialSequence3ctgatacagataggtagcat20421DNA人工序列ArtificialSequence4ccgagcagatggttaaggcta21521DNA人工序列ArtificialSequence5ccgagcagatggttaaggctc21620DNA人工序列ArtificialSequence6gcgagagttctcggcgttga20721DNA人工序列ArtificialSequence7gcatgcaacctagatgttagg21821DNA人工序列ArtificialSequence8gcatgcaacctagatgttagt21920DNA人工序列ArtificialSequence9agaaaaataatgcttcctcg201021DNA人工序列ArtificialSequence10tgacgaagaactagtacaatg211121DNA人工序列ArtificialSequence11tgacgaagaactagtacaatt211221DNA人工序列ArtificialSequence12gaacacctctcctccggaggc211321DNA人工序列ArtificialSequence13tacctgtcggtatgtctactc211421DNA人工序列ArtificialSequence14tacctgtcggtatgtctactt211520DNA人工序列ArtificialSequence15ttcctctggcttgatattca201621DNA人工序列ArtificialSequence16cagaacaattatcatgtagcg211721DNA人工序列ArtificialSequence17cagaacaattatcatgtagct211820DNA人工序列ArtificialSequence18tgcactggttctccagttat201921DNA人工序列ArtificialSequence19gaggttaactccttcctcttc212021DNA人工序列ArtificialSequence20gaggttaactccttcctcttt212120DNA人工序列ArtificialSequence21ttcttatgtgaatctgaagg202221DNA人工序列ArtificialSequence22gtcctgcgtcggatccgtggc212321DNA人工序列ArtificialSequence23gtcctgcgtcggatccgtggt212420DNA人工序列ArtificialSequence24tggattacaagctaccatat202519DNA人工序列ArtificialSequence25gtattatcttgtaatccta192619DNA人工序列ArtificialSequence26gtattatcttgtaatcctg192720DNA人工序列ArtificialSequence27aaggtccatatataatgata202820DNA人工序列ArtificialSequence28tctctcatgcattgtatgca202920DNA人工序列ArtificialSequence29tctctcatgcattgtatgcg203020DNA人工序列ArtificialSequence30tcatcgagacgaccaaccaa203171DNA人工序列ArtificialSequence31tatgctagtgctatgcttgtgtgtgactgtaccatactttcttatcatgctacctatctg60tatcagttatg71

权利要求：1.与小麦抗条锈病基因QYr.sicau-1B.1连锁的SNP分子标记，其特征在于，所述分子标记为KASP-Yr，该分子标记与小麦抗条锈病QTLQYr.sicau-1B.1共定位于小麦1B染色体长臂上，且与QYr.sicau-1B.1之间的遗传距离小于1.3cM，所述SNP分子标记的多态性为AG。2.如权利要求1所述的SNP分子标记，其特征在于，其可通过以下3条引物扩增得到：所述3条引物包括2个上游引物和1条通用下游引物，所述2个上游引物5’端分别修饰不同的荧光基团；3条引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO.1、2和3所示。3.小麦抗条锈病QTLQYr.sicau-1B.1在调控小麦抗条锈病性状中的应用，所述的小麦抗条锈病QTLQYr.sicau-1B.1，来自母本‘20828’，该QTL位于小麦染色体1B长臂上，在RefSeqv1.0基因组版本的物理位置为474Mb。4.用于检测小麦抗条锈病QTLQYr.sicau-1B.1连锁的SNP分子标记的特异性引物组合，其特征在于，含有核苷酸序列如SEQIDNO.1～3所示的引物。5.含有权利要求4所述特异性引物组合的试剂盒。6.权利要求1-2任一所述的SNP分子标记或权利要求4所述的特异性引物组合或权利要求5所述的试剂盒在鉴定小麦抗条锈病基因QYr.sicau-1B.1中的应用。7.权利要求1-2任一所述的SNP分子标记或权利要求4所述的特异性引物组合或权利要求5所述的试剂盒在鉴定抗条锈病小麦中的应用。8.权利要求1-2任一所述的SNP分子标记或权利要求4所述的特异性引物组合或权利要求5所述的试剂盒在小麦种质资源改良或在小麦抗条锈病材料创制或在小麦分子辅助育种中的应用。9.如权利要求6-8任一所述的应用，其特征在于，以待测植株样品的基因组DNA作为模板，用荧光定量PCR引物进行荧光定量PCR扩增，利用扩增结果进行基因型分型，将能够读取到引物SEQIDNO.2所修饰的荧光的植株鉴定为含有小麦抗条锈病QTLQYr.sicau-1B.1的植株。10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述荧光定量PCR的扩增反应体系：5μLMasterMix、3条引物SEQIDNO.1、2和3按照10ngμL的浓度，分别加入120μL，120μL和300μL并添加ddH2O460μL进行混合后作为混合引物使用，混合引物1.4μL、5ng模板DNA、双蒸水加至总量为10μL，同时需添加至少3个独立的以双蒸水代替DNA模板的空白；荧光定量PCR程序：94℃预变性15min；94℃变性20s、61℃复性延伸60s，共10个循环；94℃变性20s、55℃复性延伸60s，共26个循环；获得的结果进行基因分型；检测PCR扩增产物荧光，如果能够读取引物SEQIDNO.2所修饰的荧光，则待测植株为具有抗条锈病性状的小麦资源。

百度查询： 四川农业大学 与小麦抗条锈病基因QYr.sicau-1B-1连锁的SNP分子标记与应用

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