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申请/专利权人：东北林业大学

摘要：本发明涉及一种农杆菌介导的刚毛柽柳遗传转化体系的构建方法，属于植物基因工程技术领域。为解决目前刚毛柽柳转化体系无法获得稳定的遗传性状的问题，本发明提供了一种农杆菌介导的刚毛柽柳遗传转化体系的构建方法，具体步骤包括获取刚毛柽柳外植体并将在暗条件下预培养、制备含有农杆菌的侵染液、侵染、共培养和抗性芽的筛选，最终获得刚毛柽柳遗传转化株系。本发明优化了刚毛柽柳组织扩繁体系，提高了转化效率，建立了刚毛柽柳的稳定遗传转化体系，为农杆菌稳定转化刚毛柽柳打下坚实的基础，为后续刚毛柽柳基因功能及调控机制深入研究和转基因新品系的获得奠定了坚实的基础。

主权项：1.一种农杆菌介导的刚毛柽柳遗传转化体系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1、获取刚毛柽柳外植体并将所述外植体在暗条件下预培养，所述刚毛柽柳外植体为生长良好的刚毛柽柳组培苗的茎段基部组织，所述预培养为25±2℃条件下培养1d，预培养的培养基为12MS+22.50gL蔗糖+6.50gL琼脂，PH5.8~6.0；步骤2、制备含有农杆菌的侵染液，所述农杆菌为发根农杆菌35S::pBI21-GFP，所述发根农杆菌35S::pBI21-GFP的培养方法为：挑取发根农杆菌35S::pBI21-GFP单克隆接种于LB液体培养基中培养至OD600=2.0，然后转接于LB液体培养基中二次培养至OD600=0.8；3000g离心10min收集菌体；所述侵染液由12MS+22.50gL蔗糖+150μM乙酰丁香酮+0.04vv％Tween20组成；所述含有农杆菌的侵染液中农杆菌的OD600=0.8；步骤3、侵染：在暗条件下将步骤1经过预培养的刚毛柽柳外植体浸没于步骤2制备的含有农杆菌的侵染液中，暗条件下25℃，90rmin侵染15min；步骤4、共培养：取出完成侵染的外植体置于共培养培养基上，所述共培养培养基为12MS+22.50gL蔗糖+1.006-BA培养基，暗条件下25±3℃培养2~3d；步骤5、抗性芽的筛选：完成共培养的刚毛柽柳外植体先用含有抑菌剂的清洗培养基清洗，再置于诱导不定芽分化培养基上，清洗培养基为12MS+200mgLTimentin+100mgLCef液体培养基，所述清洗处理的时间为10~20min；将完成共培养的刚毛柽柳外植体转移到诱导不定芽分化培养基上，分化出不定芽后转移到诱导不定芽伸长的伸长培养基上，不定芽长至一定长度后转移到诱导不定芽生根的生根培养基上，最终获得刚毛柽柳遗传转化株系；所述分化培养基的配方为：12MS+22.50gL蔗糖+6.50gL琼脂+1.50gL碳粉+0.50~2.00mgL6-BA+0.10~1.00mgLNAA+200mgLTimentin+100mgLCef+35mgLKan；所述伸长培养基的配方为：12MS+22.50gL蔗糖+6.50gL琼脂+1.50gL碳粉+0.50~1.00mgL6-BA+0.05~0.20mgLNAA+200mgLTimentin+100mgLCef+35mgLKan；所述生根培养基的配方为：12MS+22.50gL蔗糖+6.50gL琼脂+1.50gL碳粉+0.50~2.00mgLIBA+200mgLTimentin+100mgLCef+45mgLKan。

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百度查询： 东北林业大学 一种农杆菌介导的刚毛柽柳遗传转化体系的构建方法