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申请/专利权人：博雅干细胞科技有限公司

摘要：本发明涉及使用脐带血制备I型NKT细胞的方法，包括步骤：分离单个核细胞，将所得单个核细胞用人造血祖细胞富集抗体富集得到富集造血祖细胞，再用人全血CD34+分选试剂盒使其与CD34正选抗体混合物处理，正选得到CD34+细胞，将分离得到的CD34+细胞与间充质干细胞共培养，诱导分化得到iNKT细胞，再将该诱导分化得到的iNKT细胞使用NK增补培养基进行扩增培养，得到iNKT细胞。本发明还涉及一种脐带血来源的iNKT细胞，其是本发明方法制备得到的。还涉及用于本发明方法的完全培养基以及NK增补培养基。本发明使用脐带血制备I型NKT细胞的方法呈现例如扩增倍数高的诸多优点。

主权项：1.制备I型NKT细胞的方法，包括如下步骤：1分离单个核细胞：取单个核细胞来源组织转移到AXP®单个核细胞分离系统的配套处理耗材内，装入AXP®单个核细胞分离系统，放入离心机，以离心力1500g离心20min，再以离心力120g离心10min后取出，自动分离得到单个核细胞，导出AXP®数据，得到单个核细胞的分离数量；2磁珠法分选CD34+细胞：将步骤1得到的单个核细胞使用PBS重悬例如至浓度2×108细胞ml，根据RosetteSepTM人造血祖细胞预富集试剂盒说明书操作法加入50µlmlRosetteSep人造血祖细胞富集抗体，室温15℃-25℃孵育20分钟，按照1：1比例加入PBS清洗，以离心力100g离心10min，去上清，得到富集造血祖细胞，用PBS重悬至浓度1×108细胞ml；然后根据EasySepTM人全血CD34+分选试剂盒说明书操作法加入人CD34正选抗体混合物抗体混合物：细胞的比为1ml：20~30ml细胞，正选得到CD34+细胞，用完全培养基重悬，待用；3诱导分化iNKT细胞：将分离得到的CD34+细胞与间充质干细胞以40~60：1细胞数比例在完全培养基中例如CD34+细胞的浓度为1×106mL以37℃、5%CO2共培养7-9天，每隔2天半量更换完全培养基，诱导分化得到iNKT细胞；4扩增iNKT细胞：将诱导分化得到的iNKT细胞使用NK增补培养基进行扩增培养，间隔2天半量换液，以37℃、5%CO2培养至第7~9天，得到大量的iNKT细胞，以离心力100g离心10min，去上清，使用生理盐水或平衡盐液重悬，再次以离心力100g离心10min，去上清，得到iNKT细胞；任选地用生理盐水或平衡盐液重悬；例如，所述生理盐水是氯化钠注射液例如浓度为0.9%的氯化钠注射液，所述平衡盐液是乳酸钠林格注射液。

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