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申请/专利权人：中国科学院苏州生物医学工程技术研究所

摘要：本发明涉及一种基于FQ‑RCA的RNA等温实时基因分型方法，属于分子生物学技术领域。本发明提供了一种基于FQ‑RCA的RNA等温实时基因分型方法，先通过splintRDNA连接酶连接分别与野生型RNA和突变型RNA完全匹配的两条锁式探针，形成DNA环状模板，再通过含有两套FQ探针的RCA反应进行实时荧光信号检测。此方法将FQ探针和RCA技术结合，实现了对RCA反应中突变位点的实时检测，并结合了splintRDNA连接酶能够以RNA为夹板高效连接DNA的特性，以及两套锁式探针相互竞争减少非特异性连接的方法，可以直接以RNA为靶标进行SNP基因分型检测，无需逆转录成cDNA。

主权项：1.一种基于FQ-RCA的RNA等温实时基因分型试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的成分包含锁式探针杂交试剂、锁式探针环化试剂、滚环扩增引物杂交试剂、滚环扩增试剂、检测探针杂交试剂和淬灭探针杂交试剂；所述锁式探针杂交试剂的成分包含第一锁式探针和第二锁式探针；所述第一锁式探针和第二锁式探针能够分别与野生型RNA模板和突变型RNA模板特异性结合，形成第一杂合体和第二杂合体；所述锁式探针环化试剂的成分包含splintRDNA连接酶；所述splintRDNA连接酶能够将第一杂合体和第二杂合体环化，形成第一环化产物和第二环化产物；所述滚环扩增引物杂交试剂的成分包含滚环扩增引物、dNTP和DNA聚合酶；所述滚环扩增引物能够分别与第一锁式探针和第二锁式探针互补配对，进而与第一环化产物和第二环化产物特异性结合，最终进而引发以第一环化产物和第二环化产物为模板的滚环扩增；所述dNTP能够在DNA聚合酶的作用下进行第一环化产物和第二环化产物的滚环扩增，形成第一环状扩增产物和第二环状扩增产物；所述检测探针杂交试剂的成分包含第一检测探针和第二检测探针；所述第一检测探针和第二检测探针上分别偶联有第一荧光标记物和第二荧光标记物，且所述第一检测探针和第二检测探针能够分别与第一锁式探针和第二锁式探针的反义链互补配对；所述淬灭探针杂交试剂的成分包含淬灭探针；所述淬灭探针上偶联有荧光淬灭标记物，且所述淬灭探针能够分别与第一锁式探针和第二锁式探针的反义链互补配对；当淬灭探针与第一检测探针共同结合在第一环状扩增产物上时，所述第一荧光标记物的荧光信号会被荧光淬灭标记物淬灭；当淬灭探针与第二检测探针共同结合在第二环状扩增产物上时，所述第二荧光标记物的荧光信号会被荧光淬灭标记物淬灭。

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