申请/专利权人：郑州大学

申请日：2023-01-03

公开（公告）日：2024-05-28

公开（公告）号：CN116298305B

主分类号：G01N33/68

分类号：G01N33/68;G01N33/533;G01N33/541;C07K16/40;C12N15/65;C12N15/66;C12N15/85;C12N5/10

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.05.28#授权;2023.07.11#实质审查的生效;2023.06.23#公开

摘要：本发明公开了一种抗NT5C1A自身抗体检测方法及体外诊断试剂盒，所述的检测方法包括提取人肌肉组织总RNA及获得总cDNA、构建重组表达pSJMY‑NT5C1A‑GFPC载体、制备含重组表达载体pSJMY‑NT5C1A‑GFPC的细胞、构建并验证CBA间接免疫荧光法和筛选应用于临床血清标本NT5C1A抗体等步骤。本发明提出一种适用于临床的抗NT5C1A自身抗体检测方法，通过构建带有荧光标签的NT5C1A真核表达载体，并利用脂质体转染的方式建立基于HEK293细胞的双色间接免疫荧光方法，制备抗NT5C1A抗体细胞，测定患者血清中抗NT5C1A抗体，可以最大限度的维持蛋白的空间构象，提高检测的特异性，对患者的早期诊断和疗效评价均有明确的指导意义，且该方法中所使用的试剂均为常规试剂，便于获得，有利于降低临床检测成本，具有显著的社会效益。

主权项：1.一种抗NT5C1A自身抗体检测方法，其特征在于：所述的检测方法包括以下步骤：步骤一，提取人肌肉组织总RNA及获得总cDNA从临床中获取人肌肉组织，采用TRIzol试剂提取RNA，在多功能酶标仪上检测RNA浓度及纯度，用DEPC处理水校正零点；用DEPC处理水稀释RNA样品；读取OD260、OD280值和OD260OD280的比值，当OD260OD280的比值范围在1.8-2.0时，进行反转录反应，获取cDNA；步骤二，构建重组表达pSJMY-NT5C1A-GFPC载体根据NT5C1A序列设计NT5C1A基因扩增引物，利用已设计合成好的引物进行RT-PCR获取人NT5C1A基因，将RT-PCR扩增产物NT5C1A与T载体进行TA克隆，将大小位置正确的转化子接菌，培养，提取质粒，限制性酶切及测序鉴定，挑选正确的转化子进行重组组合，从T载体上切胶回收，插入到C端含有GFP绿色荧光标签的空载体pSJMY-GFPC、连接或者直接做无缝克隆，转化大肠杆菌，筛选阳性克隆，以上下游引物对转化子进行菌落扩增，培养重组克隆成功的转化子，提取质粒，进一步通过目的基因PCR、限制性酶切、基因测序方式对重组质粒进行鉴定，选择正确的载体进行质粒的大量提取，保菌；步骤三，制备含重组表达载体pSJMY-NT5C1A-GFPC的细胞接种HEK293T细胞至24孔培养板及腔室载玻片系统培养24h，当细胞达80％融合时采用Turbo8.0转染试剂进行转染，分别将pSJMY-NT5C1A-GFPC载体与转染试剂按照质量体积比0.1ug:0.3ul转入HEK293T细胞，放至CO2培养箱培养48h后，荧光显微镜下观察转染效率并记录、拍照，当转染效率达到60%-80%，将转染细胞弃上清，使用PBS清洗一遍细胞，弃PBS，用多聚甲醛固定细胞20min后，再使用PBS清洗2遍，加入含Triton、BSA进行破膜及封闭3小时至过夜，从而得到通透的含重组表达载体pSJMY-NT5C1A-GFPC的细胞步骤四，构建并验证CBA间接免疫荧光法构建步骤：a.将兔源一抗按照1：400-1:1000的比例进行稀释；b.转染细胞表面封闭液弃去，加入稀释后的兔源一抗，37℃环境下孵育30min-2h；c.用含Triton的PBS洗液洗涤；d.加入AlexaFluor®594二抗，孵育30min-2h；e.含Triton的PBS洗液洗涤；f.加入磷酸盐缓冲液进行免疫荧光观察，使用荧光显微镜的蓝色激发光和绿色激发光分别进行观察拍照；g.对转染细胞提取全蛋白，进行蛋白免疫印迹实验，验证重组表达载体在细胞中NT5C1A蛋白表达情况；步骤五，筛选应用于临床血清标本NT5C1A抗体通过步骤四构建的CBA间接免疫荧光法测定人血清中的抗NT5C1A抗体情况，根据免疫荧光图进行临床阳性判定，具体步骤为：a.获取临床患者的血清样本，并对血清标本进行比例稀释；b.弃去转染细胞表面封闭液，加入稀释后的血清样本，37℃环境下孵育30min-2h；c.用含Triton的PBS洗液洗涤；d.加入AlexaFluor®594二抗，孵育30min-2h；e.含Triton的PBS洗液洗涤；f.加入磷酸盐缓冲液进行免疫荧光观察，使用荧光显微镜的蓝色激发光和绿色激发光分别进行观察拍照，获取免疫荧光图；g.根据免疫荧光图的显色情况进行临床阳性判定，判定方法为：pSJMY-NT5C1A-GFPC转染HEK293T细胞后，GFP和NT5C1A融合显示绿色荧光，抗NT5C1A血清抗体与转染的NT5C1A蛋白结合，在AlexaFluor®594二抗作用下，显示红色荧光，若绿色荧光和红色荧光Merge后荧光呈黄色，则证明抗体阳性，否则为阴性；所述检测方法为非疾病的诊断和治疗目的。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 郑州大学 一种抗NT5C1A自身抗体检测方法及体外诊断试剂盒

免责声明
1、本报告根据公开、合法渠道获得相关数据和信息，力求客观、公正，但并不保证数据的最终完整性和准确性。
2、报告中的分析和结论仅反映本公司于发布本报告当日的职业理解，仅供参考使用，不能作为本公司承担任何法律责任的依据或者凭证。

阅读全文 双屏查看 官方信息 专利公告 收藏专利 下载PDF 下载WORD