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申请/专利权人：浙江大学绍兴研究院
申请日：2024-03-18
公开（公告）日：2024-06-21
公开（公告）号：CN118222684A
主分类号：C12Q1/6869
分类号：C12Q1/6869
优先权：
专利状态码：在审-公开
法律状态：2024.06.21#公开
摘要：本发明提供了一种精确测定mRNApolyA长度的测序方法，包括以下步骤：合成结合寡聚核苷酸链；通过生物素标记连接磁珠与结合寡聚核苷酸链；从细胞中提取RNA样品；使用磁珠与RNA样品中的polyA互补配对；通过RNA连接酶将结合寡聚核苷酸链与RNA的3’端polyA尾紧密连接起来；使用USER酶在反转录前释放polydT序列；进行逆转录反应，并添加模板置换寡核苷酸合成第二链；对合成的双链cDNA进行PCR扩增，纯化后进行SMRT测序并分析。本发明最大限度地避免了退火异常造成的测序误差，确保了任一核酸移位都不能连接到mRNA上，从而可以精确测定polyA的长度和位置。
主权项：1.一种精确测定mRNApolyA长度的测序方法，其特征在于，包括以下步骤：1合成可以特异性结合polyA的结合寡聚核苷酸链：IndexiSp18SEQIDNO：1iBiodTCCGiSpC3SEQIDNO：2NNNNNNNNNNNNReversecomplementarysequenceofindexideoxyUTTTTTTTT3InvdT；其中，Index为8个碱基对的样本指标；iSp18是合成的内含18个原子的六乙二醇间隔物；iBiodT作为生物素标记用于后续与链霉亲和素磁珠结合；iSpC3是C3间隔剂；Reversecomplementarysequenceofindex为Index的反向互补序列；ideoxyU用于反转前USER酶的识别并消化；3InvdT为3'端反向dT；2通过生物素标记iBiodT连接磁珠与结合寡聚核苷酸链；3从细胞中提取RNA样品；4使用磁珠与RNA样品中的polyA互补配对；5通过T4RNA连接酶，将含有dT序列的结合寡聚核苷酸链与RNA的3’端polyA尾紧密连接起来；6使用USER酶特异性识别dU位点，在反转录前释放polydT序列；7进行逆转录反应，并添加模板置换寡核苷酸合成第二链；8对合成的双链cDNA进行PCR扩增，纯化后进行SMRT测序并分析。
全文数据：
权利要求：
百度查询： 浙江大学绍兴研究院 一种精确测定mRNA poly(A)长度的测序方法
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