申请/专利权人：江苏大学;江苏省农业科学院

申请日：2024-03-14

公开（公告）日：2024-06-07

公开（公告）号：CN118147218A

主分类号：C12N15/84

分类号：C12N15/84;A01H4/00;A01H5/00;A01H6/46

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2024.06.25#实质审查的生效;2024.06.07#公开

摘要：本发明提供了一种异源四倍体象草的基因组编辑方法，包括象草幼穗诱导及外植体的制备、胚性愈伤的诱导、基因组编辑载体的构建、农杆菌侵染、抗性愈伤筛选及分化、象草再生编辑植株的获取等步骤。本发明提供的CRISPRCas9介导的基因组编辑系统在异源四倍体象草中具有精准高效的靶向突变能力，技术完善，为象草的分子育种和基因的功能研究提供了良好的技术支撑，可促进象草育种及产业化的发展。

主权项：1.异源四倍体象草的基因组编辑方法，其特征在于，包括如下步骤：1短日照处理诱导象草植株孕穗：选取株高20-50cm的象草植株，采用人工遮光方式进行短日照处理，诱导和促进象草植株孕穗分化；2制备幼穗外植体：将幼穗外部的包叶消毒后，剥出幼穗作为离体组织培养的外植体材料；3诱导胚性愈伤组织：将步骤2的幼穗组织切成2-3mm长的穗段，转移到愈伤组织诱导培养基上，25℃暗培养3-4周后获得硬质的胚性愈伤组织；4预培养：将诱导的胚性愈伤组织颗粒转接到预培养基中，于25℃条件下暗培养2d；5质粒DNA转化根癌农杆菌：将pYLCRISPRCas9-MH-NACP基因组编辑双元表达载体的质粒DNA转化到根癌农杆菌的电转化感受态细胞中；6制备转化用的农杆菌侵染液：挑取转化后的根癌农杆菌单菌落接种于添加50mgL卡那霉素和25mgL利福平的YEB液体培养基中，28℃、180rpm振荡培养2d；取活化的菌液以1:1000比例接种到含50mgL卡那霉素和25mgL利福平的YEB液体培养基中，在28℃、180rpm的转速振荡培养过夜，至菌液OD600为0.6，离心收集菌体后用含100μM乙酰丁香酮的12MS液体培养基重悬，重悬菌液OD600为1.0；7农杆菌侵染胚性愈伤组织：将步骤4预培养后的胚性愈伤组织颗粒浸入到含有基因组编辑重组载体质粒的农杆菌菌液中30min，中间不断晃动；8共培养：将步骤7侵染后的胚性愈伤组织颗粒，吸干表面残余菌液后，接种到共培养基上，室温条件下暗培养2-3d；9洗菌：将共培养后的胚性愈伤组织颗粒用含300mgL特泯菌的无菌水清洗，室温下50rpm振荡30min，然后用无菌滤纸吸去愈伤组织表面的水分，超净台上吹干30min；10筛选抗性愈伤组织：将胚性愈伤组织接种到含40mgL潮霉素和300mgL特泯菌的抗性愈伤组织筛选培养基上，25℃暗培养，每隔20d继代培养一次，40d后获得抗性愈伤组织；11分化抗性植株：将获得的抗性愈伤组织接种到含20mgL潮霉素和300mgL特泯菌的分化培养基上，25℃、16h光照8h黑暗条件下培养，诱导抗性不定芽的分化，每隔15d继代一次；12诱导生根：分化的抗性芽从基部切下后，转接到含20mgL潮霉素和300mgL特泯菌的生根筛选培养基上，25℃、16h光照8h黑暗条件下培养，诱导生根，将生根的再生苗移栽至营养土中，获得完整的拟转化植株；13分子鉴定：根据基因编辑靶位点的上下游序列设计特异PCR引物对，然后以拟转化植株基因组DNA为模版进行PCR扩增，将PCR产物进行测序分析，从中鉴定出靶位点已被成功编辑的基因组编辑植株。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 江苏大学;江苏省农业科学院 异源四倍体象草的基因组编辑方法

免责声明
1、本报告根据公开、合法渠道获得相关数据和信息，力求客观、公正，但并不保证数据的最终完整性和准确性。
2、报告中的分析和结论仅反映本公司于发布本报告当日的职业理解，仅供参考使用，不能作为本公司承担任何法律责任的依据或者凭证。

阅读全文 双屏查看 官方信息 专利公告 收藏专利 下载PDF 下载WORD