申请/专利权人：天津博创合成生物科技有限公司

申请日：2024-01-16

公开（公告）日：2024-06-14

公开（公告）号：CN117802004B

主分类号：C12N1/20

分类号：C12N1/20;C12P19/40;C07H19/16;C07H1/06;C12R1/125

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.06.14#授权;2024.04.19#实质审查的生效;2024.04.02#公开

摘要：本发明涉及一种高纯度腺嘌呤核苷的制备方法，利用枯草芽孢杆菌bcsw2023‑1为发酵菌株，发酵过程中，在产腺苷阶段采用流加复合碳源的补料发酵工艺生产腺嘌呤核苷，发酵结束后，利用陶瓷膜过滤、超滤过滤、脱色、浓缩、结晶、重结晶等方法获得腺苷粗品；然后采用腺嘌呤核苷作为模板，制备其表面分子印迹色谱材料，装填成色谱柱，通过色谱柱层析技术制备纯化粗提后的腺嘌呤核苷，去除其中的杂质；最后将纯化后的腺嘌呤核苷进行结晶，得到固体的高纯产物。本方法制备的腺嘌呤核苷发酵液经过粗提后，腺嘌呤核苷纯度可达到98.5%以上，经过本发明特制的分子印迹材料纯化后，纯度可以达到99.9%。

主权项：1.一种高纯度腺嘌呤核苷的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：包括利用bcsw2023-1菌株发酵生产含腺嘌呤核苷的发酵液步骤；包括含腺嘌呤核苷的发酵液纯化形成腺苷粗品的步骤；包括腺苷粗品除杂的步骤，最终获得高纯腺嘌呤核苷产物；所述腺嘌呤核苷的发酵液纯化形成腺苷粗品的步骤包括：陶瓷膜过滤、超滤膜过滤、脱色、浓缩、结晶、以及重结晶步骤；所述菌株名称为：bcsw2023-1,分类命名：枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis，保藏编号为CGMCCNo.29120，保藏日期为：2023年11月23日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；所述bcsw2023-1发酵的步骤包括：①斜面培养：将枯草芽孢杆菌bcsw2023-1接种至活化斜面，30-33℃培养20-28h；②种子培养：用无菌纯化水将斜面上的菌体刮下，用玻璃珠打碎后，按照1-5%接种量接种至种子培养基，30-33℃，210-230rpm恒温摇床培养6-10h，作为发酵种子液；③分批发酵培养：按15-20%的接种量转接至装有发酵培养基的发酵罐中，31-35℃，溶氧维持在10-40%，用20%浓度的NH3·H2O调节pH，pH为6.0-7.0，培养时间40-50h，并且在菌体OD600*20达到1.0-1.5以后，并且pH开始反弹到7.0-7.5时，开始流加复合碳源，流加到发酵终点前3-10h；所述菌株发酵中每次流加复合碳源的量为10-30mLh，并且维持发酵液中的还原糖含量为1.0-3.0%，复合碳源的组成为葡萄糖、甘油、乳糖、蔗糖的其中任意两种组合；所述腺苷粗品除杂的步骤包括：采用以腺嘌呤核苷分子印迹色谱材料装填色谱柱，柱层析后，获得腺嘌呤核苷；所述腺嘌呤核苷分子印迹色谱材料制备方法为：步骤1：乙烯基修饰多孔硅胶的制备：取10g5μm100Å的球形多孔硅胶，置于250ml反应釜中，再加入6g三乙氧基乙烯基硅烷，150ml甲苯，加热回流反应17小时，过滤，得到乙烯基修饰的多孔硅胶；步骤2：表面分子印迹材料的制备：将10g5μm100Å的乙烯基球形多孔硅胶，置于250ml反应釜中，再加入150ml乙腈、6g甲基丙烯酸基丙烯酸、1.5g二甲基丙烯酸乙二醇酯和0.6g腺嘌呤核苷，加入100mg偶氮二异丁氰，60℃下搅拌，反应24小时，滤出，得到5μm100Å腺嘌呤核苷的表面分子印迹材料；或者，所述腺嘌呤核苷分子印迹材料制备方法如下：步骤1乙烯基修饰多孔硅胶的制备：取10g10μm，200Å的球形多孔硅胶，置于250ml反应釜中，再加入6g三乙氧基乙烯基硅烷，150ml甲苯，加热回流反应17小时，过滤，得到乙烯基修饰的多孔硅胶；步骤2表面分子印迹材料的制备：将10g10μm200Å的乙烯基球形多孔硅胶，置于250ml反应釜中，再加入180ml乙腈、5g甲基丙烯酸基丙烯酸、1.2g二甲基丙烯酸乙二醇酯和0.5g腺嘌呤核苷，加入80mg偶氮二异丁氰，60℃下搅拌，反应24小时，滤出，得到10μm200Å腺嘌呤核苷的表面分子印迹材料。

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