申请/专利权人：华南理工大学

申请日：2024-04-15

公开（公告）日：2024-06-14

公开（公告）号：CN118028207B

主分类号：C12N1/21

分类号：C12N1/21;C12N15/33;C12N15/70;A61K39/39;A61K39/00;A61K47/46;A61P35/00;A61P37/04;C12R1/19

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.06.14#授权;2024.05.31#实质审查的生效;2024.05.14#公开

摘要：本发明公开了一种菌影的制备方法、应用该菌影的组合物及其制备方法，该菌影的制备方法包括：将pET29a‑E‑α3质粒与EcNΔtnaA::T7RNAP感受态细胞混合后在28‑40℃下孵育0.5‑1小时，以将质粒转入到感受态细胞中，筛选得到重组菌株；将所述重组菌株于LB培养基中培养并加入IPTG诱导噬菌体α3裂解蛋白表达；收集培养后的所得溶液中的菌影加入冻干保存剂进行冻干保存，得到的大肠杆菌菌影。与现有技术相比，本发明利用特定方法制备大肠杆菌菌影作为免疫治疗的佐剂后与肿瘤抗原进行组合，使大肠杆菌菌影具有免疫活性成分和药物载体双重功能，可以携带和释放药物，同时还能够激活免疫系统，增强免疫治疗的效果，也即提高了基于大肠杆菌菌影作为佐剂用于免疫治疗时的应用效果。

主权项：1.一种菌影的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：将pET29a-E-α3质粒与EcNΔtnaA::T7RNAP感受态细胞混合后电击，并28-40℃下超声震荡0.5-1小时，以将质粒转入到感受态细胞中，筛选得到重组菌株；将所述重组菌株于LB培养基中培养并加入IPTG诱导噬菌体α3裂解蛋白表达；收集培养后的所得溶液中的菌影加入冻干保存剂进行冻干保存，得到的大肠杆菌菌影；所述将pET29a-E-α3质粒与EcNΔtnaA::T7RNAP感受态细胞混合后电击，并在28-40℃下超声震荡0.5-1小时，以将质粒转入到感受态细胞中，筛选得到重组菌株，包括：质粒孵育：在50~200ulEcNΔtnaA::T7RNAP感受态细胞悬液中加入1~10ulpET29a-E-α3质粒并混合均匀，于冰上孵育3~5min；所述pET29a-E-α3质粒的浓度为50~200ngul；所述感受态的浓度为1*10^7cfu；电转：使菌液均匀地分布于电击杯中，放入电转化仪的杯槽中，电脉冲条件：1.5KV、电阻200Ω、电容25μF；电击后迅速加入1mL无抗LB液体培养基，轻轻吹打均匀；复苏：28-40℃下，超声震荡培养0.5~1h进行复苏，并同时利用290nm～312nm紫外光间歇性照射，每次照射时长为2-4分钟，相邻两次照射的间隔时间为3-8分钟，4000rpm离心30s，弃掉800μL的上清液，将剩余菌体沉淀重悬；紫外光间歇性照射中相邻两次照射的间隔时间大于每次照射时长；所述超声震荡培养的功率为8-12W；涂布：将菌体沉淀涂布于含卡那霉素的LB固体培养基，37℃过夜培养；再次电转：取阳性克隆细胞继续培养两代后，将其再次制成感受态细胞，加入pLysS-OmpA-ATRAM质粒，再次进行电转的步骤，并涂布菌体沉淀于含卡那霉素及氯霉素的LB固体培养基中对转化细胞进行筛选，取阳性克隆细胞得到重组菌株；所述pLysS-OmpA-ATRAM质粒的浓度为50~200ngul。

全文数据：

权利要求：

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