申请/专利权人：华南师范大学

申请日：2019-07-31

公开（公告）日：2024-06-25

公开（公告）号：CN112301102B

主分类号：C12Q1/6844

分类号：C12Q1/6844;C12Q1/6848;C12N15/113;C12N15/10

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.06.25#授权;2021.02.23#实质审查的生效;2021.02.02#公开

摘要：本发明公开了一种高特异性的环介导等温扩增方法，包括以下步骤：1设计扩增引物；2设计sgRNA；3扩增；4扩增产物的特异性检测。本发明所述的扩增方法可以达到飞克级别的污染去除，有效地降低了传统LAMP方法检测的假阳性率，提高了检测的准确率。同时，本发明还包括所述高特异性的环介导等温扩增方法在基因检测中的应用。

主权项：1.一种高特异性的环介导等温扩增方法，包括以下步骤：1）设计扩增引物：在LAMP扩增方法的FIP引物的F1c区域和F2区域之间或BIP引物的B1c区域和B2区域之间加入PAM的互补位点NCC，使LAMP的产物含有PAM位点NGG；具体的，在LAMP扩增方法的FIP引物的F1c区域和F2区域之间或BIP引物的B1c区域和B2区域之间加入两个碱基C，当LAMP扩增方法的FIP引物的F1c区域和F2区域之间或BIP引物的B1c区域和B2区域之间有一个碱基C时，则在所述的FIP引物的F1c区域和F2区域之间或BIP引物的B1c区域和B2区域之间的碱基C旁边再添加一个碱基C；2）设计sgRNA：根据步骤（1）所述引物设计sgRNA，使得Cas9sgRNA复合物可以特异性识别并切割靶标序列以外的含有PAM位点的先前扩增产物；具体的，首先通过桥式PCR的方法得到用于转录sgRNA的DNA模板；在PCR的过程中仅用两条长引物，正向引物F长为64-nt，包含T7启动子和20-nt的与靶标DNA相关序列，下游引物R长80-nt用于编码sgRNA的3’末端序列，两条引物有20-nt长的完全互补序列，PCR产物用T7-RNA聚合酶进行体外转录得到100-nt的sgRNA；3）扩增：将Cas9sgRNA复合物加入扩增体系，按照正常LAMP扩增程序进行扩增，所述sgRNA为步骤2）设计的序列；具体的，将Cas9和sgRNA在37°C或室温下孵育10分钟，形成Cas9sgRNA复合物，然后加入到扩增体系中用37°C孵育5-20min，此时Cas9sgRNA复合物开始在体系中寻找含有PAM位点的LAMP扩增产物，Cas9sgRNA复合物在PAM位点下游3bp的位置切断产物，使得体系中污染的产物无法引起LAMP扩增，再按照正常LAMP扩增程序进行扩增；4）扩增产物的特异性检测。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 华南师范大学 一种高特异性的环介导等温扩增方法及其应用

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