申请/专利权人：中国科学院西北高原生物研究所;西宁市科技创新促进中心

申请日：2022-06-10

公开（公告）日：2024-06-25

公开（公告）号：CN115385927B

主分类号：C07D493/04

分类号：C07D493/04;A61K31/37;A61P39/06;A23L33/105

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.06.25#授权;2022.12.13#实质审查的生效;2022.11.25#公开

摘要：本发明公开了异叶青兰中呋喃香豆素类天然自由基清除剂的分离工艺和应用。具体制备工艺：提取、硅胶柱前处理、微孔树脂柱富集、在线自由基清除剂组分筛选、Diol二醇基柱富集、在线自由基清除剂组分再筛选、反相制备柱制备及反相制备液相色谱纯化。制备工艺中的提取溶剂、硅胶柱、微孔树脂柱、Diol二醇基柱、反相色谱柱所使用的溶剂及分离材料均可回收利用；原料成本低，甲醇室温冷浸提取，硅胶和微孔树脂分离材料可装于中压柱层析系统中，实现规模化操作；高压色谱分离纯化可以保证产品的纯度大于95％。

主权项：1.异叶青兰中呋喃香豆素类天然自由基清除剂的分离工艺，其特征在于，具体包括如下步骤：步骤1，提取：将异叶青兰全草阴干，粗碎后按料液比1g：5～100mL的甲醇提取，在室温下提取2～4次，每次8～12h，过滤、合并滤液，即滤液A，该滤液A按硅胶的量：异叶青兰药材的量＝1:1～5拌样并减压干燥，即得异叶青兰提取物拌样样品；步骤2，硅胶柱前处理：异叶青兰提取物拌样样品，该样品经装有硅胶的中压色谱柱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第一个主要的色谱峰馏分，该馏分经减压干燥即得异叶青兰含有目标成分的组分Fr1；其中，所述硅胶柱分离的工作参数为色谱柱柱长460mm、直径15-49mm，固定相为硅胶，流动相A为甲醇，B为二氯甲烷，色谱条件为0-30min，0％B，30-60min，0-100％B，60-90min，100％B，进样量为20-130g，流速为10-57mLmin；步骤3，微孔树脂柱富集：Fr1用加入其质量5～10倍的甲醇溶解得到滤液B，滤液B按硅胶的量：样品的量＝1:1～1.5拌样并干燥，即得异叶青兰含有目标成分的组分Fr1拌样样品，该样品经装有微孔树脂的中压色谱柱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第四个主要的色谱峰馏分，该馏分经减压干燥即得异叶青兰含有目标成分的组分Fr14；之后取Fr1及Fr11-15样品适量加入甲醇配成50～100mgmL的甲醇溶液在高效液相色谱仪上进行分析；其中，微孔树脂柱分离的工作参数为：色谱柱柱长460mm、直径15-49mm，微孔树脂柱固定相为CHP20P，流动相A为水，B为甲醇，色谱条件为0-150min，20-100％B，150-210min，100％B，进样量为10-55g，流速为10-57mLmin；HPLC分析条件为：ReproSil-PurC18AQ250×4.6mm，5μm色谱柱，检测波长为210nm，流动相A为色谱纯水，流动相B为乙腈溶液，按照0-60min，40-75％B，流动相流速为1.0mLmin；步骤4，在线自由基清除剂组分筛选：在所述异叶青兰含有目标成分的组分Fr14中加入其质量5～10倍的体积浓度为70～90％的甲醇进行溶解，配制样品浓度为50.0～100.0mgmL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到异叶青兰Fr14甲醇样品溶液，即滤液C，取1mL滤液C，利用在线HPLC-DPPH色谱联用系统筛选异叶青兰含有目标成分的组分中自由基清除剂；其中，所述在线HPLC-DPPH色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用ReproSil-PurC18AQ250×4.6mm，5μm色谱柱，检测波长为210nm；第二台高效液相色谱仪进乙醇溶解的DPPH溶液，检测波长为517nm；步骤5，Diol二醇基柱富集：滤液C按硅胶的量：样品的量＝1:1～1.5拌样并干燥，即得异叶青兰含有目标成分的组分Fr14拌样样品，该样品经装有微孔树脂的中压色谱柱分离，经检测波长为280nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第二个主要的色谱峰馏分，该馏分经减压干燥即得异叶青兰含有目标成分的组分Fr142；其中，Diol二醇基柱分离的工作参数为：色谱柱柱长500mm、直径50mm，固定相为Diol，流动相A为正己烷，B为乙酸乙酯，色谱条件为0-90min，0-100％B，检测波长为280nm，进样量为60g，流速为57mLmin；步骤6，在线自由基清除剂组分再筛选：在所述异叶青兰含有目标成分的组分Fr142中加入其质量5～10倍的体积浓度为70～90％的甲醇进行溶解，配制样品浓度为50.0～100.0mgmL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到异叶青兰Fr142样品溶液，即滤液D，取1mL滤液D，利用在线HPLC-DPPH色谱联用系统筛选异叶青兰含有目标组分中自由基清除剂；其中，所述在线HPLC-DPPH色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用ReproSil-PurC18AQ250×4.6mm，5μm反相色谱柱，检测波长为210nm；第二台高效液相色谱仪进乙醇溶解的DPPH溶液，检测波长为517nm；步骤7，反相制备色谱柱制备：所述滤液D经反相制备色谱柱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中对应的色谱峰馏分Fr1423、Fr1424和Fr1425，经减压干燥分别得到含有目标化合物1的组分Fr1423，含有目标化合物2和3的组分Fr1424和含有目标化合物4的组分Fr1425；其中，反相制备柱制备的工作参数为：ReproSil-PurC18AQ反相制备柱柱长250mm、直径20mm，固定相为5μm，流动相A为色谱纯水，流动相B为乙腈溶液，按照0-60min，40-75％B洗脱，进样体积为0.5mL，流速为19mLmin；步骤8，Fr1423、Fr1424和Fr1425反相制备液相色谱纯化：分别含有目标化合物1-4的组分Fr1423、Fr1424和Fr1425分别用体积分数为70～100％的甲醇-水溶液溶解，配制样品浓度为20.0～50.0mgmL，均经0.45μm微孔滤膜过滤，得到滤液，即滤液E、F和G，使用在线HPLC-DPPH色谱联用系统对滤液E、F和G进行分析和活性峰筛选，然后将分析条件进行线性放大，对滤液E、F和G进行反相液相制备色谱纯化，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集滤液E、F和G制备色谱图中主要的色谱峰馏分，该色谱峰馏分经减压干燥即得纯度大于95％的自由基清除剂isodemethylfuropinarine，标记为1号；demethylfuropinarine，标记为2号；alloimperatorin，标记为3号；alloisoimperatorin，标记为4号；其中，化学结构式分别为：

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