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申请/专利权人：长江大学

摘要：本发明涉及瞬时表达体系构建技术领域，公开了研究载体农药韧皮部传导性的蓖麻瞬时表达体系构建方法，包括蓖麻幼苗的培育、制备用于转化蓖麻幼苗的农杆菌侵染液和农杆菌侵染液转化蓖麻幼苗。本发明可简单高效且快速准确地在蓖麻幼苗中实现外源基因的瞬时表达，可用于研究植物转运蛋白对载体农药韧皮部传导效率的影响；结果显示瞬时表达RcLHT7后载体农药在蓖麻韧皮部的传导效率提升了近2.3倍。

主权项：1.一种分析载体农药韧皮部传导性的蓖麻瞬时表达体系构建方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：蓖麻幼苗的培育将蓖麻种子置于500mL烧杯中，加入适量清水没过种子，于27℃±1℃条件下浸泡24h，之后将蓖麻种子播种至蛭石上培育6d，培育温度为27℃±1℃，湿度为80%±5%，之后挑选长势一致的蓖麻幼苗，蓖麻幼苗的胚轴为3.5cm，轻轻剥去胚乳备用；S2：制备用于转化蓖麻幼苗的农杆菌侵染液采用冻融法将含有外源目的基因的植物表达载体pART27-eGFP转化至农杆菌GV3101中，将转化成功的农杆菌GV3101接种至LB培养基中，于28℃、220rpm条件下震荡培养至OD600=1.2，LB培养基含终浓度50μgmL壮观霉素、20μgmL利福平和40μgmL庆大霉素；然后将培养获得的菌液于5000rpm条件下离心5min，收集菌体，再使用MES缓冲液将菌体重悬至OD600=1.2，室温静置2h，MES缓冲液含10mMMES、10mMMgCl2和200μM乙酰丁香酮，pH=5.5；S3：农杆菌侵染液转化蓖麻幼苗将经步骤S1处理之后的蓖麻幼苗置于250mL烧杯中，蓖麻幼苗的根部朝上、子叶朝下，向250mL烧杯中倒入经步骤S2处理之后的农杆菌重悬液，再将250mL烧杯置于真空抽滤仪中于0.09MPa条件下抽滤20min+20min，即先真空抽滤20min，然后释放真空再抽滤20min，倒掉农杆菌重悬液后再将蓖麻幼苗重新置于250mL烧杯中，蓖麻幼苗的根部朝下、子叶朝上，向250mL烧杯中加入霍格兰氏营养液，将250mL烧杯转移至植物冷光源培养箱中于18℃条件下培养72h，每隔24h更换一次霍格兰氏营养液，即获得蓖麻瞬时表达体系；步骤S2中的所述外源目的基因为蓖麻氨基酸转运蛋白RcLHT7的CDS序列，所述CDS序列为SEQIDNO：1所示。

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百度查询： 长江大学 研究载体农药韧皮部传导性的蓖麻瞬时表达体系构建方法