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申请/专利权人：蒋学峰

摘要：本发明公开了一种基于TaqMan多重探针实时荧光定量PCR鉴定布鲁氏菌的方法，利用布鲁氏菌Bm‑IS711、Ba‑alkB、Bo‑ABCtp、Bs‑aABCtp基因序列设计特异性引物和探针，并对该方法的特异性、敏感性及重复性进行了评价，所建立的检测方法可对不同种属来源的布鲁氏菌基因组进行特异性检测，对其他细菌无特异性扩增曲线，该检测方法基因拷贝数的检出限为29.7copiesμL，批内变异系数为0.15％～6.69％，批间变异系数为0.21％～4.73％，具有较高的可重复性，采用TaqMan多重探针实时荧光定量PCR检测临床样本，其灵敏度明显高于血培养检测，可对患者做出准确、及时的诊断。

主权项：1.一种基于TaqMan多重探针实时荧光定量PCR鉴定布鲁氏菌的方法，其特征在于：包括如下方法步骤：步骤一：布鲁氏菌及其他菌株生化鉴定：布鲁氏菌标准株、大肠杆菌标准株、金黄色葡萄球菌标准株、肺炎链球菌标准株、乳酸乳球菌标准株、阴道加德纳菌标准株、幽门螺杆菌标准株、嗜酸乳杆菌标准株、鲍曼不动杆菌标准株经梅里埃全自动细菌鉴定仪VITEK-2鉴定；步骤二：引物及探针设计：从GenBank查找布鲁氏菌的16S基因NR_043003.1和插入元件Bm-IS711CP044985.1、Ba-alkBAF148682.1、Bo-ABCtpBOV_A0503、Bs-aABCtpCS875_04735的序列，使用BeaconDesigner7软件设计16S基因鉴定引物及TaqMan多重探针实时荧光定量PCR检测用的引物和TaqMan探针，用FAM荧光发光基团标记探针的5’端，用BHQ淬灭基团标记3’端；步骤三：布鲁氏菌基因组DNA提取：布鲁氏菌标准菌株使用液体培养基扩大培养，后将其调整成OD值为0.5的菌液，80℃水浴箱灭活15min，使用全自动核酸提取仪SSNP-2000B及配套试剂提取布鲁氏菌DNA，使用NanoDrop100超微量分光光度计检测浓度及纯度；步骤四：构建阳性质粒：PCR扩增获得布鲁氏菌插入元件Ba-alkB、Bo-ABCtp、Bm-IS711、Bs-aaABCtp片段，用高保真酶扩增并进行PCR产物纯化，以pUC19为骨架载体，将Ba-alkB、Bo-ABCtp、Bm-IS711、Bs-aaABCtp片段连接到骨架载体上，转入大肠杆菌DH5α进行扩大培养及鉴定，采用超微量分光光度计定量测定提取重组的阳性质粒DNA，重组阳性质粒拷贝数利用公式计算得到布鲁氏菌质粒拷贝数为2.97×1010copiesμL，将阳性质粒进行10倍梯度稀释，取10个稀释浓度依次为2.97×1010copiesμL～2.97×100copiesμL，每个稀释浓度均设置3次重复，根据Ct值绘制标准曲线，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳试验验证；步骤五：TaqMan多重探针TaqMan多重探针实时荧光定量PCR检测：采用ABI7500荧光定量检测系统进行荧光定量PCR，定量试剂使用PremixExTaqTM，按照反应体系计算所需的引物体积，将上游引物和下游引物以一定量进行混合，形成primerMix，加样顺序为RNase-FreeWater、masterMix、primermix、TemplatecDNA，加样完成后将反应板放入离心机，离心10sec去除气泡，以及使溶液完全到反应管底部，打开ABI7500仪器，设置相对定量反应程序；步骤六：TaqMan多重探针实时荧光定量PCR敏感性、特异性和重复性检测：灵敏度检测：将四种阳性质粒进行10倍梯度稀释，从2.97×109copiesμL稀释至2.97×100copiesμL，各取2.0μL作为模板使用该TaqMan多重探针实时荧光定量PCR系统进行检测，以ddH2O为模板作为阴性对照，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证；特异性检测：以四种阳性质粒以及实验室保存的其他细菌DNA包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、乳酸乳球菌、阴道加德纳菌、幽门螺杆菌、嗜酸乳杆菌、鲍曼不动杆菌作为扩增模板，以ddH2O为模板作为阴性对照，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳试验验证；重复性检测：将阳性质粒进行10倍梯度稀释，从2.97×108copiesμL稀释至2.97×101copiesμL用于计算批间及批内变异系数，将同批次配制的反应体系重复检测3次并计算批内变异系数；其次进行3个不同批次配制的反应体系并计算批间变异系数，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳试验验证。

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