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申请/专利权人：10月12日大学医院生物医学研究基金会;国家公共部门基金会卡洛斯三世国家肿瘤学研究中心(F.S.P.CNIO)

摘要：本发明聚焦在用于确定增殖性疾病已经被治疗的受试者中微小残留病的存在或缺失的方法、试剂盒和系统，其中所述方法、试剂盒和系统包含：A扩增并测序包含在来自治疗所述疾病之前从所述受试者获得的生物样品的基因组DNA中的至少一个核苷酸序列，以获得从左到右读取的第一个字符列表；B扩增并测序包含在来自治疗所述疾病之后从所述受试者获得的生物样品的基因组DNA中的至少一个核苷酸序列，以获得从左到右读取的第二个字符列表；其中当核苷酸序列突变时，它是所述增值性疾病的遗传标志物；C确定步骤B中获得的每个第二个字符列表与步骤A中获得的每个第一个字符列表的相似性程度DS；D为步骤B中获得的每个第二个字符列表选择最高值的DS，DSHV；E将具有大于阈值T的DSHV的第二个字符列表的数量相加，以获得Lc，F将第二个字符列表的总数Lt相加，G根据任一下式计算微小残留病MRD的水平：MRD＝LcxkLtxD或MRD＝LcLt或MRD＝gxLcxDkLt2；H确定i所述遗传标志物的最小变体读取频率minVRF；ii所述遗传标志物的检测限D‑limit；iii平均突变噪音avMut和iv平均位置噪音avPos；I从minVRF、D‑limit、avMut和avPos的较大者或从minVRF和D‑limit的较大者确定实验灵敏度ES；J通过比较微小残留病的水平值与ES的值、minVRF、D‑limit、avMut和avPos的值，或minVRF和D‑limit的值确定所述受试者中微小残留病的存在或缺失；其中当微小残留病的所述水平等于或大于所述ES、minVRF、D‑limit、avMut或avPos值时，所述受试者中存在微小残留病。

主权项：1.用于确定疾病已被治疗的受试者中微小残留病MRD存在或缺失的系统，其中所述疾病是增殖性疾病，其中所述系统包含以下：A-装置，其用于使用包含基因座特异性正向引物和基因座特异性反向引物的一对引物，通过聚合酶链式反应扩增包含在来自治疗所述疾病之前从所述受试者获得的生物样品的基因组DNA中的至少一个核苷酸序列；和-装置，其用于对每个扩增的核苷酸序列进行测序，由此从因此测序的每个核苷酸序列中获得从左到右读取的第一个字符列表；B-装置，其用于使用与A中相同的基因座特异性正向引物和相同的基因座特异性反向引物，通过聚合酶链式反应扩增以量D包含在来自治疗所述疾病之后从所述受试者获得的生物样品的基因组DNA中的至少一个核苷酸序列，其中所述基因组DNA具有所述生物样品的每个二倍体细胞的平均重量k；和-装置，其用于对每个扩增的核苷酸序列进行测序，由此从因此测序的每个核苷酸序列获得从左到右读取的第二个字符列表；其中在步骤A和B中扩增的每个核苷酸序列短于400个核苷酸，并且是基因的突变核苷酸序列或未突变的核苷酸序列，其中当核苷酸序列突变时，它是遗传标志物，包含选自以下的突变：单核苷酸变体突变、插入缺失突变和体细胞基因重排突变；C装置，其用于对于B中获得的每个第二个字符列表，确定与A中获得的每个第一个字符列表的相似性程度，其中在B中获得的第二个字符列表与在A中获得的第一个字符列表的相似性程度DS由以下确定：i分别计数第二和第一个字符列表中在第一和第二个字符列表中相同的字符总数Cc；ii计数第一和第二个字符列表中的字符总数Ct；和iii根据下式计算DS：DS＝CcCtD装置，其用于为B中获得的每个第二个字符列表选择最高值的DS，DSHV；E装置，其用于将具有大于阈值T的DSHV的第二个字符列表的数量相加，以获得与第一个字符列表相同的第二个字符列表的总数Lc；F装置，其用于将以下相加iLc；和ii不具有大于T的DSHV的第二个字符列表的数量，以获得第二个字符列表的总数Lt；和G装置，其用于根据任一下式计算微小残留病，MRD的水平：MRD＝LcxkLtxD或MRD＝LcLt或MRD＝gxLcxDkLt2其中g是每个细胞的基因拷贝数，D以ng为单位，k以ng细胞为单位；H装置，其用于确定：i所述遗传标志物的最小变体读取频率minVRF，其中minVRF根据下式计算：minVRF＝kD其中D和k如上所定义；和ii所述遗传标志物的检测限，D-limit，通过以下：a通过用不包含所述遗传标志物的10份基因组DNA溶液稀释包含所述遗传标志物的一份基因组DNA溶液获得第一组合物；b确定所述第一组合物中所述遗传标志物的MRD水平；c通过用不包含所述遗传标志物的10份基因组DNA溶液稀释一份所述第一组合物来获得第二组合物；d确定所述第二组合物中所述遗传标志物的MRD水平；e通过用不包含所述遗传标志物的10份基因组DNA溶液稀释一份所述第二组合物来获得第三组合物；f确定所述第三组合物中所述遗传标志物的MRD水平；g通过用不包含所述遗传标志物的10份基因组DNA溶液稀释一份所述第三组合物来获得第四组合物；h确定所述第四组合物中所述遗传标志物的MRD水平；i计算：-第一、第二和第三组合物中所述遗传标志物的MRD水平的平均对数avlogMRD1和第一、第二和第三组合物中所述遗传标志物的浓度的平均对数avlogC1；和-第二、第三和第四组合物中所述遗传标志物的MRD水平的平均对数avlogMRD2和第二、第三和第四组合物中所述遗传标志物的浓度的平均对数avlogC2；j计算：-第一组合物中所述遗传标志物的MRD水平的对数与avlogMRD1之间的差异，D1A；-第二组合物中所述遗传标志物的MRD水平的对数与avlogMRD1之间的差异，D1B；-第三组合物中所述遗传标志物的MRD水平的对数与avlogMRD1之间的差异，D1C；-第一组合物中所述遗传标志物的浓度的对数与avlogC1之间的差异，D1D；-第二组合物中所述遗传标志物的浓度的对数与avlogC1之间的差异，D1E；-第三组合物中所述遗传标志物的浓度的对数与avlogC1之间的差异D1F；-第二组合物中所述遗传标志物的MRD水平的对数与avlogMRD2之间的差异，D2A；-第三组合物中所述遗传标志物的MRD水平的对数与avlogMRD2之间的差异，D2B；-第四组合物中所述遗传标志物的MRD水平的对数与avlogMRD2之间的差异，D2C；-第二组合物中所述遗传标志物的浓度的对数与avlogC2之间的差异，D2D；-第三组合物中所述遗传标志物的浓度的对数与avlogC2之间的差异，D2E；和-第四组合物中所述遗传标志物的浓度的对数与avlogC2之间的差异D2F；k计算：-R1，通过D1A乘以D1D；-R2，通过D1B乘以D1E；-R3，通过D1C乘以D1F；-R4，通过D1A乘以D1A；-R5，通过D1B乘以D1B；-R6，通过D1C乘以D1C；-R7，通过D2A乘以D2D；-R8，通过D2B乘以D2E；-R9，通过D2C乘以D2F；-R10，通过D2A乘以D2A；-R11，通过D2B乘以D2B；-R12，通过D2C乘以D2C；l计算：-S1，使用下式：S1＝R1+R2+R3R4+R5+R6-S2，使用下式：S2＝R7+R8+R9R10+R11+R12；m比较S1和S2，其中：-当S2比S1低至少30％时，第三组合物的浓度为D-limit；和-当S2等于S1或比S1低少于30％时，使用所述第一组合物代替包含所述遗传标志物的所述基因组DNA溶液重复Hiia至Hiil；和iii平均突变噪音avMut，当所述突变是单核苷酸变体突变时，使用a装置，其用于使用与A中相同的基因座特异性正向引物和相同的基因座特异性反向引物，通过聚合酶链式反应扩增来自从没有所述疾病且没有所述遗传标志物的受试者获得的生物样品的基因组DNA的至少一个核苷酸序列；b装置，其用于对每个扩增的核苷酸序列进行测序，由此从因此测序的每个核苷酸序列中获得从左到右读取的第三个字符列表；c装置，其用于在没有所述疾病且没有所述遗传标志物的m个受试者中重复Hiiia和Hiiib，其中m至少为9；和d装置，其用于计算与从测序所述遗传标志物获得的相同的第三个字符列表的平均分数，其中所述平均分数是avMut；和iv平均位置噪音avPos，当所述突变是单核苷酸变体突变时，使用装置用于计算与所述遗传标志物和所述非突变序列相同的每个核苷酸序列的变体读取频率VRF，但其中所述遗传标志物中负责所述单核苷酸变体突变的核苷酸不同于所述遗传标志物和所述非突变序列中的核苷酸，其中所述VRF值的均值为avPos；I装置，其用于确定实验灵敏度ES，其中ES为：i当所述突变是单核苷酸变体突变时，如H中计算的minVRF、D-limit、avMut和avPos中的较大者；和ii当所述突变是插入缺失突变或体细胞基因重排突变时，如H中计算的minVRF和D-limit中的较大者；和J装置，其用于通过以下任一方法确定所述受试者中微小残留病的存在或缺失：i将在G中计算的微小残留病MRD的水平值与在I中确定的实验灵敏度ES的值进行比较，其中a当所述MRD值的水平等于或大于所述ES值时，所述受试者中存在微小残留病；和b当所述MRD值的水平小于所述ES值时，所述受试者中不存在微小残留病或ii当所述突变是单核苷酸变体突变时，将G中计算的微小残留病MRD的水平值与H中计算的minVRF的值进行比较，其中a当所述MRD值的水平等于或大于所述minVRF值时，所述受试者中存在微小残留病；和当所述MRD值的水平小于所述minVRF值时，将在G中计算的微小残留病MRD的水平值与在H中计算的avMut的值进行比较，其中b当所述MRD值的水平等于或大于所述avMut值时，所述受试者中存在微小残留病；和当所述MRD值的水平小于所述avMut值时，将在G中计算的微小残留病MRD的水平值与在H中计算的avPos的值进行比较，其中c当所述MRD值的水平等于或大于所述avPos值时，所述受试者中存在微小残留病；和当所述MRD值的水平小于所述avPos值时，将在G中计算的微小残留病MRD的水平值与在H中计算的D-limit的值进行比较，其中d当所述MRD值的水平等于或大于所述D-limit时，所述受试者中存在微小残留病；和e当所述MRD值的水平小于所述minVRF、avMut、avPos和D-limit值时，所述受试者中不存在微小残留病；或iii当所述突变为插入缺失突变或体细胞基因重排突变时，将G中计算的微小残留病MRD的水平值与I中计算的minVRF的值进行比较，其中f当所述MRD值的水平等于或大于所述minVRF值时，所述受试者中存在微小残留病；和当所述MRD值的水平小于所述minVRF值时，将在G中计算的微小残留病MRD的水平值与在H中计算的D-limit的值进行比较，其中g当所述MRD值的水平等于或大于所述D-limit时，所述受试者中存在微小残留病；和h当所述MRD值的水平小于所述minVRF和D-limit时，所述受试者中不存在微小残留病。

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百度查询： 10月12日大学医院生物医学研究基金会 国家公共部门基金会卡洛斯三世国家肿瘤学研究中心(F.S.P.CNIO) 用于确定疾病已被治疗的受试者中微小残留病(MRD)存在或缺失的方法