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申请/专利权人：中国农业科学院兰州兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心兰州分中心)
摘要：本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种猪BECN1基因敲除细胞的构建方法及其应用。首先设计合成针对BECN1基因的带有酶切位点的向导RNA及其互补序列，利用碱基互补配对原则将sgRNA及其互补序列连接为双链sgRNA片段，通过分子克隆重组技术构建重组CRISPRCas9质粒，将重组质粒转染到猪肺上皮细胞中，设计sgRNA验证引物验证sgRNA活性，再通过嘌呤霉素药物筛选阳性单克隆细胞株，提取单克隆细胞株的DNA和蛋白质，进行BECN1基因测序及蛋白表达检测，最后获得BECN1基因敲除的PPE细胞。本方法简便高效，构建的敲除细胞系可广泛应用于BECN1基因功能和相关通路研究。
主权项：1.一种猪BECN1基因敲除细胞的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1在sgRNA上加上Bbs1限制性内切酶的粘性末端和接头，得到插入片段；所述sgRNA的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；2将所述步骤1得到的插入片段及其互补序列进行退火，得到双链片段；所述互补序列的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；3将所述步骤2得到的双链片段与PX459载体进行连接，将得到的连接产物转化感受态大肠杆菌，提取质粒，得到重组质粒PX459M-BECN1-sgRNA；所述PX459载体经Bbs1酶酶切；4将所述步骤3得到的重组质粒PX459M-BECN1-sgRNA与Lip2000脂质体、PPE细胞混合、转染，得到转染细胞；5将所述步骤4得到的转染细胞经嘌呤霉素筛选阳性单克隆细胞株，获得猪BECN1基因敲除的PPE细胞系。
全文数据：
权利要求：
百度查询： 中国农业科学院兰州兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心兰州分中心) 一种猪BECN1基因敲除细胞的构建方法及其应用
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