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申请/专利权人:北京林业大学
摘要:本发明提供了一种发根根瘤菌介导的油松不定根遗传转化方法,将带有RUBY报告基因的载体转化到发根根瘤菌中;当油松种子苗的茎长距根部超过3cm时,切掉根部,将伤口处浸没在发根根瘤菌重悬液中,并进行抽真空;将植株根部伤口处裹满发根根瘤菌菌体后,移栽至土培基质中培养30~45d,当愈伤组织分化为再生不定根时,观察再生不定根的颜色,判断是否为植物阳性转化不定根。本发明所述构建的体系突破了油松遗传转化困难的技术屏障,为油松重要基因的功能以及根茎之间信号转导等相关研究工作提供了技术操作手段,并且为后续油松乃至其他针叶树种的关键功能基因功能鉴定以及遗传修饰种质创制提供了技术支撑和指导。
主权项:1.一种发根根瘤菌介导的油松不定根遗传转化方法,包括如下步骤:(1)将含有RUBY报告基因和目标基因的载体转化到发根根瘤菌中,得到含有RUBY报告基因和目标基因的发根根瘤菌菌体;(a)将含有RUBY报告基因和目标基因的载体用化学转化法转化发根根瘤菌K599感受态细胞中;(b)将转化后的发根根瘤菌接入抗性TY培养基中,28℃震荡培养12~16h,得到发根根瘤菌菌液;每升抗性TY培养基含有75~100mg壮观霉素、5g蛋白胨、3g酵母提取物和1M氯化钙;(c)将发根根瘤菌的菌液进行7000~8000rpm离心收菌,使菌体附着在离心管壁上,并用抗性TY培养基进行重悬,涂布于抗性TY固体培养基平板上,平板放置于28℃培养箱倒置培养2~3d,直到在固体培养基表面长出菌层;(2)将油松种子种在湿润且蓬松的水苔上,培养得到幼苗;(3)当植物外植体的茎长距根部超过3cm时,切掉所述植物根部,切根的位置为植物的根茎结合处以上0.5~1cm处,将植物伤口处浸没在发根根瘤菌重悬液中,然后对其进行抽真空,抽真空时的真空压力值为0.05~0.08MPa,时长为5~60min;然后将所述植物外植体从重悬液中取出,将其根部伤口处裹满含有RUBY报告基因和目标基因的发根根瘤菌菌体,然后移栽至土培基质中;重悬液配方为10mM2-吗啉乙磺酸、10mM氯化镁,使用KOH调pH为5.6,再加入乙酰丁香酮150μM;将发根根瘤菌菌液进行7000~8000rpm离心收菌,使菌体附着在离心管壁上,并用重悬液进行等体积重悬2次,最终使菌液浓度OD600在0.8~1.2之间,得到发根根瘤菌重悬液;(4)培养30~45d后,当愈伤组织分化为再生不定根时,观察再生不定根的颜色,判断是否为植物阳性转化根;阳性转化根为粉红色。
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权利要求:
百度查询: 北京林业大学 一种发根根瘤菌介导的油松不定根遗传转化方法
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