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申请/专利权人：沈阳农业大学

摘要：本发明提供了一种基于CoIP‑AGE‑MS技术分离植物体内互作蛋白的方法，涉及分子生物学技术领域。包括：利用在基因N端融合A序列标签并在C端融合B序列标签的策略，作为后续亲和分离纯化和化学发光显色反应的免疫源。按照CoIP富集蛋白复合物、AGE分离蛋白复合物及切胶回收蛋白复合物的技术流程对蛋白复合物进行富集、分离和纯化回收，减少背景污染等影响。本发明对CoIP的技术路线进行改良，结合甲醛交联处理，利用微球菌酶消化染色质释放蛋白复合体，优化蛋白提取流程，提高CoIP的纯化效率；通过AGE，驱离杂蛋白，降低杂信号；利用二次亲和反应放大蛋白复合体信号，便于蛋白复合体的回收和测序。

主权项：1.一种基于CoIP-AGE-MS技术分离植物体内互作蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：1以目的基因为模板，使用带有标签序列的目的基因引物对目的基因进行PCR扩增，得到N端融合A标签，且C端融合B标签的融合蛋白：“A-目的基因-B序列”，其中A和B标签指任何一种标签；2将植物表达载体多克隆位点进行酶切，得到酶切载体，将所述酶切载体与步骤1得到的A-目的基因-B序列进行连接，得到连接产物35S::A-目的基因-B；3将所述步骤2得到的连接产物35S::A-目的基因-B转化到大肠杆菌中，提取质粒，将所述质粒转化到农杆菌中，得到35S::A-目的基因-B工程菌；4将所述步骤3得到的35S::A-目的基因-B工程菌利用瞬时转化技术转化植物，得到35S::A-目的基因-B瞬时转化株系；5将所述步骤4得到的35S::A-目的基因-B瞬时转化植株进行甲醛交联反应，得到交联植株；6提取所述步骤5得到的交联植株的蛋白；提取所述交联植株的蛋白过程中对染色质DNA进行酶解，如利用微球菌酶消化处理；7将所述步骤6得到的蛋白利用A、B标签之一进行第一次的亲和纯化如免疫沉淀或利用其他亲和纯化载体媒介，如His标签与镍柱，StreptagII与StrepTactin等各种亲和媒介，得到目的蛋白复合物、A或B标签抗体及其偶联的载体媒介的一次亲和产物复合体；8将所述步骤7得到的一次亲和产物复合体与HRP复合物进行第二次的亲和反应，以下简称二次亲和产物复合体；所述HRP复合物是指将识别另一标签的免疫抗体与识别该抗体的HRP抗体共孵育形成的信号放大复合体；9将所述步骤8得到的第二次亲和产物复合体进行洗脱反应，将载体媒介上例如磁珠与其亲和的蛋白复合物进行分离；10将所述步骤9得到的蛋白复合物的洗脱液进行电泳，利用HRP发光液对电泳后的凝胶进行发光检测，而后对显影区域进行切胶回收和MS质谱鉴定，进而鉴定蛋白复合体内的蛋白类别。

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