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申请/专利权人：华东师范大学

摘要：本发明公开了蛋白酶体激活子3相互作用蛋白1Psme3ip1基因去磷酸化定点突变小鼠模型的构建及应用。Psme3ip1基因去磷酸化定点突变小鼠模型的构建方法如下：1、确定Psme3ip1突变基因的特异性靶位点，并构建Psme3ip1基因去磷酸化定点突变敲入的打靶载体；2、设计sgRNA1序列并制备成质粒，通过体外转录的方式，获得Cas9mRNA和sgRNA1；3、将Cas9mRNA、sgRNA1和打靶载体转染至显微注射入小鼠受精卵中，培育受精卵并进行传代鉴定，构建获得Psme3ip1基因去磷酸化定点突变敲入的小鼠动物模型。本发明首次公开了Psme3ip1基因去磷酸化定点突变小鼠模型的构建方法，在制备检测治疗结肠癌药物中有很大的应用价值，为结肠癌药物的研发提供了动物模型。

主权项：1.一种Psme3ip1基因去磷酸化定点突变小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤（1）将sgRNA1与Cas9质粒体外转录成mRNA，获得有活性的sgRNA1和Cas9mRNA；所述sgRNA1的核苷酸序列如下：sgRNA1：GGTGCCTTCACTGTCTGAACTGGSEQIDNO:1；步骤（2）构建Psme3ip1基因去磷酸化定点突变的打靶载体pGEM®-TEasy-Psme3ip14A；所述构建Psme3ip1基因去磷酸化定点突变的打靶载体的步骤包括：步骤（2-1）根据打靶策略设计引物，构建左边同源臂片段LHAF、右边同源臂片段RHAF和引入点突变的序列片段4A；步骤（2-2）将LHAF、RHAF和4A通过搭桥PCR实验获得LHAF-4A-RHAF片段；步骤（2-3）将LHAF-4A-RHAF片段克隆组装到pGEM®-TEasy载体上，构建获得打靶载体pGEM®-TEasy-Psme3ip14A；步骤（2-4）通过菌落PCR鉴定和测序，确认打靶载体构建成功；步骤（2-1）中，所述打靶策略为：将Psme3ip1基因第226、227、228和230这四个位点的氨基酸Ser突变为Ala，即S226A，相对应的碱基由TCC变成GCG；S227A，相对应的碱基由AGT变成GCC；S228A，相对应的碱基由TCA变成GCA，S230A，相对应的碱基由AGT变成GCT；步骤（2-1）中，所述根据打靶策略设计引物，包括：构建LHAF片段的引物序列如下：LHAF-F:GCTGTGTGCATCGGCATCCTCCCTGGCTTGGGCGCCTACTCTGGGAGCAGTGACTCCGAASEQIDNO:2LHAF-R:TTCGGAGTCACTGCTCCCAGAGTAGGCGCCCAAGCCAGGGAGGATGCCGATGCACACAGCSEQIDNO:3构建RHAF片段的引物如下：RHAF-F:GAAGGCACCATCAATGCTACAGGGAAGATCGTCTCCTCCATCTTCCGAACCAACACCTTSEQIDNO:4RHAF-R:AAGGTGTTGGTTCGGAAGATGGAGGAGACGATCTTCCCTGTAGCATTGATGGTGCCTTCSEQIDNO:5构建点突变的序列片段4A的引物序列如下4A-F：CAGTGACTCCGAAGCGGCCGCAGACGCTGAAGGCACCATCASEQIDNO:64A-R:TGATGGTGCCTTCAGCGTCTGCGGCCGCTTCGGAGTCACTGSEQIDNO:7搭桥PCR的引物序列如下：搭桥PCR-F:GCTGTGTGCATCGGCATSEQIDNO:8搭桥PCR-R:AGGTGTTGGTTCGGSEQIDNO:9步骤（3）将有活性的sgRNA1和Cas9mRNA以及pGEM®-TEasy-Psme3ip14A注射入小鼠受精卵中；步骤（4）再将受精卵移植到C57BL6受体小鼠中孕育，构建获得Psme3ip1基因去磷酸化定点突变小鼠模型；将受精卵移植到受体小鼠中孕育具体步骤是指将显微注射后存活的受精卵移植到母鼠体内并进行阳性小鼠传代，具体步骤包括：步骤（4-1）将显微注射后存活的受精卵移植到假孕母鼠体内，生出的子代小鼠即为F0代小鼠；步骤（4-2）剪取F0代小鼠脚趾DNA，PCR扩增后进行测序鉴定，获得阳性F0代小鼠；步骤（4-3）将阳性F0代小鼠与野生型交配获得F1代小鼠，并剪取子代小鼠，经PCR扩增后进行测序鉴定；步骤（4-4）将F1代阳性小鼠杂交获得F2代小鼠；步骤（4-5）剪取F2代小鼠脚趾，PCR扩增获得产物，纯化产物，接着将PCR产物酶切，酶切后有2条带的为Psme3ip1基因去磷酸化定点突变阳性小鼠；获得F0代小鼠、F1代或者F2代小鼠脚趾DNAPCR扩增产物的引物序列包括：Psme3ip1-4A-F：TGGGAATGGCCCTTCAGCATTSEQIDNO:10；Psme3ip1-4A-R：ATCAATGGGACAGGTTTGGTCATCTSEQIDNO:11。

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百度查询： 华东师范大学 蛋白酶体激活子3相互作用蛋白1基因去磷酸化定点突变小鼠模型的构建及应用