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申请/专利权人：武汉康圣泽辉医学检验实验室有限公司;武汉康圣真源医学检验所有限公司

摘要：本发明公开了一种血浆外泌体DNA的提取方法及在肿瘤NGS建库测序中的应用，属于生物提取技术领域。该方法能分离血浆外泌体，并且从中提取外泌体DNA，并将剩余去掉外泌体的上清液用于cfDNA的提取，非常高效的获得适用于后续二代建库测序足量的外泌体DNA及去外泌体后的cfDNA。方法简单、实用、高效，也适用于多个样本的同时处理。该方法最大的优点是能够将外泌体从血浆中分离出来进行外泌体DNA提取，并将剩余样本用于提取cfDNA，可以进行常规的NGS建库测序。该方法获得的外泌体DNA纯度高，能够直接进行下游的测序及建库。其为癌症早期辅助诊断及辅助监测的标志物开发及应用提供了新思路。

主权项：1.一种血浆外泌体DNA的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、血浆外泌体的提取：a、先将保存的血浆样本经水浴解冻，在室温下、10200rpm10000g离心20-25min，去除残留碎片；将上清液移至离心管中，冰上放置保存；b、提取15mL血浆样本置于离心管中后加入750μL的1x磷酸缓冲液，涡旋混匀；再加入450μL外泌体提取试剂混匀后，将离心管竖直放于4℃静置20-30min，待孵育结束后，室温、10200rpm10000g离心5-10min；c、采用移液器将离心后的上清液移至新的离心管中；d、室温10200rpm10000g离心30-35s，移除残留液体后，获得管底沉淀部分，即为血浆外泌体；S2、外泌体DNA的提取：a、将上述血浆外泌体样本用400μL的1x磷酸缓冲液重悬后得到外泌体溶液；b、将400μL外泌体溶液加入到1.5mL离心管中，然后加40μL蛋白酶k溶液，再加入400μL裂解液，涡旋仪混匀后，盖好盖子放入56-60℃水浴锅温育10-15min；c、取出裂解后的外泌体溶液颠倒混匀后，加入800μL预冷的无水乙醇，-20℃冰箱静置10min；d、将上述溶液分3次转移至纯化柱中，室温，12000rpmmin，离心30s，去除离心管中的滤液；e、在纯化柱中加入500μL洗涤液A，静置2min，室温12000rpmmin，离心1min，弃废液；f、在纯化柱中加入500μL含有无水乙醇的洗涤液B，静置2min，室温12000rpmmin，离心1min，弃废液，重复f操作1次；g、空纯化柱继续室温12000rpmmin，离心1min，取出纯化柱放入收集管，打开纯化柱盖子放置5min，将乙醇挥发干；h、将洗脱液放入到56℃水浴锅中预热10-15min，将纯化柱转移至新的1.5mL离心管中，然后将热的洗脱液取30μL滴加到纯化柱中心膜上，静置2min立即放入离心机室温12000rpmmin，离心30s；离心得到的下层洗脱液再次加入纯化柱中静置2min后室温12000rpmmin，离心1min；收集管中的液体即为提取的外泌体DNA；所述外泌体DNA可直接应用于下游实验或保存在-80℃；S3、血浆cfDNA的提取：a、在5mL外泌体分离液中加入200μl蛋白酶K，加入BufferSDS至样品中，颠倒混匀；在55℃温育30min，每5分钟颠倒混匀；室温放置5min让消化液恢复至室温；b、加入7mL结合液和200μL磁珠至样品中，室温颠倒混匀10min；转移至磁力架上，静置5min吸附磁珠，吸弃溶液，短暂离心后，吸尽残液；c、加入1.0mL洗涤液1，涡旋5s，颠倒10-15次；转移至磁力架吸附1min，吸弃溶液；重复c操作1次；d、加入1.0mL洗涤液2，涡旋5s，颠倒10-15次；转移至磁力架吸附1min，吸弃溶液；重复d操作1次；e、短暂离心后，吸尽残液，37℃金属浴干燥10min，让磁珠完全干燥；f、加入洗脱液，37℃温育10min，转移至磁力架上吸附1min，把DNA转移至离心管中，可直接应用于下游实验或保存在-80℃。

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