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申请/专利权人：上海交通大学
摘要：本发明属于生物技术领域，涉及一种制备长单链DNA的方法，该方法以双链线型DNA分子作为模板，在其中一条单链上设计特异性切割位点，Cas9nickase蛋白对特异性切割位点进行识别并造成其中一条单链上的切刻，与变性剂进行尿素热变性并立即进行琼脂糖凝胶电泳分离长单链DNA，电洗脱凝胶中的长单链DNA，正丁醇浓缩电洗脱液，透析浓缩液回收得到指定长度的长单链DNA；本发明通过任意序列和长度的线型双链DNA获得长度可定制的单链DNA，无序列和长度限制，无需PCR，无需核酸外切酶反应或逆转录不会产生内部或末端的变异和缺失，可以获得含有正确序列的大于10kb长片段单链DNA，方法简单高效，具有广泛应用前景。
主权项：1.一种制备长单链DNA的方法，包括如下步骤：S1、提供线型双链DNA作为模板；S2、在线型双链DNA其中一条单链上设计特异性切割位点；S3、根据步骤S2设计的切割位点，合成对应的sgRNA；其特征在于，所述方法还包括如下步骤：S4、将Cas9nickase蛋白、sgRNA和线型双链DNA溶液混合，使三者的摩尔比为10：10：1，置于37℃反应1-4h；S5、将步骤S4反应结束的混合溶液与变性剂，按照体积比1：5混合均匀，置于65℃孵育10min，结束后立即冰浴2min；S6、将步骤S5变性结束的混合液立即进行0.8％～1％琼脂糖凝胶电泳，观察到分离出三个DNA条带；S7、将步骤S6电泳分离出的对应条带进行切割，得到的凝胶置于充满1xTAEbuffer的3.5KD透析袋中，加正向电压140V进行洗脱，回收透析袋中的洗脱液；S8、将步骤S7回收得到的洗脱液与适量正丁醇混合，快速涡旋混合后离心数秒，观察到下层浓缩后的DNA溶液相和上层正丁醇溶液相，弃去上层的正丁醇溶液，得到浓缩后的长单链DNA溶液；S9、将步骤S8得到的浓缩液转移至3.5KD的微量透析装置中，整个装置于50mL1xTEbuffer中4℃过夜透析，即可得到纯度高的长单链DNA溶液；其中，所述线型双链DNA的纯度要求为A260A280为1.7～1.9。
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百度查询： 上海交通大学 一种制备长单链DNA的方法
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