申请/专利权人：广东海纳川生物科技股份有限公司

申请日：2017-11-07

公开（公告）日：2018-04-13

公开（公告）号：CN107904182A

主分类号：C12N1/19(2006.01)I

分类号：C12N1/19(2006.01)I;C12N15/81(2006.01)I;C12N15/66(2006.01)I;C12P21/02(2006.01)I;C12R1/84(2006.01)N

优先权：

专利状态码：失效-发明专利申请公布后的驳回

法律状态：2022.04.08#发明专利申请公布后的驳回;2018.05.08#实质审查的生效;2018.04.13#公开

摘要：本发明公开了一种表达重组Thanatin（死亡素）抗菌肽的毕赤酵母，所述的重组Thanatin抗菌肽包括GSKKPVPIIYCNRRTGKCQRM的氨基酸序列；本发明采用毕赤酵母进行死亡素的分泌表达，实现了死亡素的大量表达，降低了生产成本；所述的毕赤酵母生产菌株，死亡素最高表达量达到0.6gL，是公开报道的最高水平，而且死亡素抗菌肽存在于发酵上清液中，不需要破碎细胞，只需要简单过滤出去菌体，即可得到杂蛋白很少的死亡素样品，便于后续死亡素的分离纯化，降低生产成本。本发明制备的死亡素样品对大肠杆菌和沙门氏菌有显著的抑菌作用。

主权项：一种表达重组Thanatin抗菌肽的毕赤酵母,其特征在于，所述的重组Thanatin抗菌肽包括SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

全文数据：_种表达重组Thanatin抗菌肽的毕赤酵母技术领域[0001]本发明涉及生物技术和基因工程技术领域，特别涉及一种表达重组Thanatin抗菌肽的毕赤酵母。背景技术[0002]死亡素（Thanatin，THA，又称死亡肽，是在昆虫斑腹刺益蝽（Podisusv印tris中发现的，是迄今为止发现的抗菌谱最广的抗菌肽之一，不仅对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌有杀灭活性，而且对某些真菌也有抑制作用，同时对哺乳动物细胞不表现出溶血性，是抗生素的潜在替代品。死亡素由21个氨基酸残基组成，在第11位和第18位含Cys残基，可形成分子内的二硫键，该二硫键对死亡素的稳定性起到重要作用。核磁共振及分子动力学模拟死亡素在水溶液中的三维结构，死亡素分子从第8位残基到C末端可形成标准的f反向平行折叠结构，N端结构高度可变，分子内有4个区域与其活性密切相关。死亡素抑囷的最小肽段由C端环和相邻残基组成，C末端Met残基的酰氨化对其抗菌活性是必要的。通过对其截短类似物以及死亡素的抗菌活性研宄发现，死亡素可能通过多种机制对微生物产生影响，其作用方式可能是引起细菌凝集和阻断细胞膜上的呼吸链，从而达到抑菌目的。[0003]斑腹刺益蝽体内死亡素含量非常低，通过提取的方法制备死亡素是非常昂贵的。通过微生物发酵生产死亡素会是一种比较经济的方法。中国专利CN102241778B、CN102863539B、CN1036419〇lB及其发表的相关论文报道了利用大肠杆菌进行死亡素与其他蛋白融合表达的方法，破碎细胞后检测融合蛋白具有抑菌活性。沈子龙等报道了利用裂殖酵母胞内表达死亡素，破碎细胞后能检测出抑菌活性。徐涛等报道了利用毕赤酵母胞内表达掌叶半夏凝集素PPA和死亡素的融合蛋白，检测发现融合蛋白没有抑菌活性。上述利用微生物表达死亡素的案例中，死亡素的表达量低，且是胞内表达，后续需要破碎细胞才能得到死亡素，增加生产成本。[0004]可见，现有技术还有待改进和提高。发明内容[0005]鉴于上述现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种表达Thanatin抗菌肽的毕赤酵母，旨在解决现有技术中死亡素表达量低，生产成本高的问题，实现死亡素的大量表达，降低生产成本。[0006]为了达到上述目的，本发明采取了以下技术方案：一种表达重组Thanatin抗菌肽的毕赤酵母，其中，所述的重组Thanatin抗菌肽包括SEQIDNo.2所示的氨基酸序列。[0007]所述的表达重组Thanatin抗囷肤的毕赤酵母中，所述的毕赤酵母包括毕赤酵母X33、毕赤酵母GS115和毕赤酵母SMD1168中的一种。[0008]所述的表达重组Thanatin抗菌肽的毕赤酵母中，所述的毕赤酵母为毕赤酵母X33。[0009]所述的表达重组Thanatin抗菌肽的毕赤酵母中，所述的表达重组Thanatin抗菌肽的载体骨架为pPICzaA。[0010]所述的表达重组Thanatin抗菌肽的毕赤酵母中，所述的Thanatin抗菌肽的表达载体为pPICzaA-THA。[0011]所述的表达重组Thanatin抗菌肽的毕赤酵母中，所述的表达载体pPlCzaA-THA的构建包括以下步骤：S001、在Thanatin抗菌肽的基因5’端添加XhoI酶切位点和Kex2切割位点CTCGAGAAAAGA,在Thanatin抗菌肽的基因3’端添加Xbal酶切位点TCTAGA，合成后得到克隆载体pUC-THA;5002、Xh〇I和Xbal限制性内切酶双酶切处理步骤S001中得到的PUC-THA克隆载体，得到Thanatin基因片段；5003、将步骤SO〇2中得到的Thanatin基因片段连接至同样被XhoI和Xbal限制性内切酶双酶切处理的pPICzaA载体，构建得到表达载体pPICzaA-THA。[0012]所述的表达重组Thanatin抗菌肽的毕赤酵母中，所述的表达载体pPICzaA-THA菌株的验证引物为：5A0X-F:5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’，3A0X-R:5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’。[0013]所述的表达重组Thanatin抗菌肽的毕赤酵母中，所述的重组Thanatin工程菌的筛选抗生素为〇.25-4mgmL的博来霉素。[0014]所述的表达重组Thanatin抗菌肽的毕赤酵母中，所述的重组Thanatin抗菌肽的诱导表达方法包括以下步骤：5004、制备种子液:挑选如权利要求1_8所述的表达重组Thanatin抗菌肽的毕赤酵母细胞，接种于25mLBMGY培养基中，3〇°C，220rpm培养24小时制备得到一级种子液;取20mL—级种子液接种于200mLBMGY培养基中，30°C，220rpm培养24小时制备得到二级种子液；SO〇5、发酵培养:将步骤S004中制备的二级种子液全部接种于5L发酵罐中，加入2LBSM培养基，控制温度30°C±0•5°C，溶氧20%±5%，PH为5•0±0•5;5006、饲喂碳源:步骤S005的培养基中的甘油耗尽后，流加10%甘油；5007、甲醇诱导:步骤S006的培养基中的甘油耗尽后，直至溶氧突然上升，饥饿半小时，流加甲醇诱导Thanatin表达，共诱导120h。[0015]所述的表重组Thanatin抗菌肽的毕赤酵母，其保藏编号为GDMCCN〇:60261。[0016]有益效果：本发明提供了一种表达重组Thanatin抗菌肽的毕赤酵母，实现了死亡素的大量表达，降低了生产成本;本发明所述的毕赤酵母生产菌株，死亡素最高表达量达到0.6gL，是公开报道的最高水平，而且死亡素抗菌肽存在于发酵上清液中，不需要破碎细胞，只需要简单过滤除去菌体，即可得到杂蛋白很少的死亡素样品，便于后续死亡素的分离纯化，降低生产成本。本发明制备的死亡素样品，对大肠杆菌和沙门氏菌有显著的抑制作用。附图说明[0017]图1为ToplO本发明所述重组处111:111抗菌肽的表达载体?？10^-1^菌落?〇^电泳验证图；其中，M:lkbplusDNAmarker;l:空菌株对照，E.coliToplO,无条带;2-3:pPICzaA-THA验证，扩增条带约〇•6kb。[0018]图2为所述死亡素表达菌株筛选图。[0019]图3为死亡素发酵上清液蛋白电泳图；其中，Marker:蛋白标准分子量，1-2:死亡素表达菌株发酵液样品。[0020]图4为死亡素质谱检测图。[0021]图5为死亡素发酵上清液抑菌圈检测图。具体实施方式[0022]本发明提供一种表达重组Thanatin抗菌肽的毕赤酵母，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。[0023]本发明提供一种表达重组Thanatin死亡素，THA抗菌肽的毕赤酵母，其中，所述的重组11^1^^11抗菌肽包括3£〇10此.2所示的氨基酸序列：GSKKPVPIIYCNRRTGKCQRM〇[0024]优选地，所述的毕赤酵母包括毕赤酵母X33、毕赤酵母GS115和毕赤酵母SMD1168中的一种。[0025]更优选地，所述的毕赤酵母为毕赤酵母X33。[0026]优选地，所述的表达重组Thanatin抗菌肽的载体骨架为pPICzaA。[0027]优选地，所述的Thanatin抗菌肽的表达载体为pPICzaA-THA。[0028]优选地，所述的表达载体pPICzaA-THA的构建包括以下步骤：3001、在1'1^111^11抗菌肽的基因5’端添加\}1〇1酶切位点和1^2切割位点CTCGAGAAAAGA，在Thanatin抗菌肽的基因3’端添加Xbal酶切位点TCTAGA，合成后得到克隆载体pUC-THA;5002、XhoI和Xbal限制性内切酶双酶切处理步骤S001中得到的pUC-THA克隆载体，得到Thanatin基因片段；5003、将步骤S002中得到的Thanatin基因片段连接至同样被XhoI和Xbal限制性内切酶双酶切处理的pPICzaA载体，构建得到表达载体pPICzaA-THA。[0029]本实施例中，所述的表达载体pPICzaA-THA菌株的验证引物为：5A0X-F:5’-GACTGGTTCCAATTGACMGC-3’，3A0X-R:5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’。[0030]本实施例中，所述的重组Thanatin工程菌的筛选抗生素为〇.25-4mgmL的博来霉素。[0031]本实施例中，所述的重组Thanatin抗菌肽的诱导表达方法包括以下步骤：5004、制备种子液:挑选如权利要求1-8所述的表达重组Thanatin抗菌肽的毕赤酵母细胞，接种于25mLBMGY培养基中，30°C，220rpm培养24小时制备得到一级种子液;取20mL—级种子液接种于200mLBMGY培养基中，30°C，220rpm培养24小时制备得到二级种子液；5005、发酵培养:将步骤S004中制备的二级种子液全部接种于5L发酵罐中，加入2LBSM培养基，控制温度30°C±0•5°C，溶氧20%±5%，PH为5•0±0.5;SO〇6、饲喂碳源:步骤S005的培养基中的甘油耗尽后，流加10%甘油;甘油能够提供使所述菌种快速生长的碳源，而且甘油便宜，容易得到，效果稳定，在使用过程中可以直接被憐酸化，从而被所述菌种利用，提高了所述菌种的生长速率;流加甘油可以除去快速利用碳源的阻遏效应，并维持适当的菌体浓度，使不致于加剧供氧矛盾，避免在培养基中积累有毒代谢物，不需要严格的无菌条件，也不会产生菌种老化和变异等问题。[0032]SO〇7、甲醇诱导：步骤S006的培养基中的甘油耗尽后，直至溶氧突然上升，饥饿半小时，流加甲醇诱导Thanatin表达，共诱导120h;所述菌株经甲醇诱导后，6000Xg离心5min，取发酵上清液检测，得到的是重组死亡素蛋白浓度。[0033]所述的表达重组Thanatin抗菌肽的毕赤酵母，现已保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编510075,保藏日期2017年10月26日，保藏编号GDMCCN〇:60261。[0034]下列实施例中未注明具体条件的实验操作，均参照《分子克隆实验指南》Mo丨ecwlarCloning:ALaboratoryManual，2002中所述的条件进行。[0035]DNA聚合酶、限制性内切酶、DNA连接酶购于NewEnglandBiolabs公司，X33毕赤酵母及其表达载体购于Invitrogen。[0036]实施例1死亡素表达菌株的构建1.1基于毕赤酵母密码子偏好性设计死亡素THA基因根据毕赤酵母Picjiapastoris密码子偏好性：氨基酸密码子使用频率％。数量PheUUU24.11963PheUUC20.61675LeuUUA15.61265LeuUUG31.52562SerUCU24.41983SerUCC16.51344SerUCA15.21234SerUCG7.4598TyrUAU16.01300TyrUAC18.11473STOPUAA0.869STOPUAG0.540CysUGU7.7626CysUGC4.4356STOPUGA0.327TrpUGG10.3834LeuCUU15.91289LeuCUC7.6620LeuCUA10.7873LeuCUG14.91215ProCCU15.81282ProCCC6.8553ProCCA18.91540ProCCG3.9320HisCAU11.8960HisCAC9.1737HisCAA25.42069HisCAG16.31323ArgCGU6.9564ArgCGC2.2175ArgCGA4.2340ArgCGG1.9158LieAUU31.12532LieAUC19.41580LieAUA11.1906MetAUG18.71517ThrACU22.41820ThrACC14.51175ThrACA13.81118ThrACG6.0491AsnAAU25.12038AsnAAC26.72168LysAAA29.92433LysAAG33.82748SerAGU12.51020SerAGC7.6621ArgAGA20.11634ArgAGG6.6539ValGUU26.92188Val⑶C14.91210ValGUA9.9804ValGUG12.3998AlaGCU28.92351AlaGCC16.61348AlaGCA15.11228AlaGCG3.9314AspGAU35.72899AspGAC25.92103GluGAA37.43043GluGAG29.02360GlyGGU25.52075GlyGGC8.1655GlyGGA19.11550GlyGGG5.8468设计死亡素THA的基因序列（SEQIDNo.l:GGTTCTAAGAAACCTGTGCCTATCATCTATTGTAACAGAAGAACCGGTAAGTGTCAACGT60ATGTAA66基因序列由上海生工生物工程股份有限公司合成，其对应的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示：GSKKPVPIIYCNRRTGKCQRM。1.2表达载体pPICzaA-THA的构建在死亡素THA基因5’端添加Xhol酶切位点和Kex2切割位点（CTCGAGAAAAGA，保证分泌的死亡素能被正确切割信号肽;在THA基因3’端添加Xbal酶切位点TCTAGA;所得基因序列提交上海生工生物工程股份有限公司合成，得到克隆载体pUC-THAdhoI和Xbal限制性内切酶双酶切处理pUC-THA克隆载体得到死亡素THA片段，连接至同样被Xhol和Xbal限制性内切酶双酶切处理的pPICzaA载体，构建死亡素THA表达载体pPICzaA-THA。该表达载体利用A0X1启动子在甲醇诱导下表达a-信号肽和死亡素融合蛋白，融合蛋白在N端a-信号肽的引导下转运至内质网，进而在高尔基体内被Kex2蛋白酶切割Kex2位点，从而释放出天然的死亡素THA蛋白多肽，并在高尔基体内完成蛋白的翻译后修饰，最终分泌至细胞外。[0037]连接产物42°C热激转化至大肠杆菌ToplO感受态细胞，涂布于LB抗性平板博来霉素），37°C过夜培养至长出单菌落。利用验证引物：5A0X-F:5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’（SEQIDNo.3，3A0X-R:5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC_3’（SEQID吣.4，挑单菌落菌落?〇?验证阳性转化子，进行DNA电泳验证，电泳验证图如图1所示，目的条带约0•6kb;挑取阳性转化子测序，正确菌株保存于甘油管中。[0038]1.3死亡素工程菌的构建Pmel限制性内切酶单酶切处理pPICzaA-THA表达载体，切胶回收线性化表达载体，电转1•5-2•5kv至X33毕赤酵母感受态细胞或其他毕赤酵母如GS115、SMD1168等，菌液涂布于YPD平板含0_25-4mgml博来霉素），30°C培养2-3天，直至长出单菌落。挑取几百个单菌落，培养评价死亡素的表达，检测发酵上清液的抑菌圈，其抑菌圈如图2所示，通过抑菌圈大小选择死亡素最优表达菌株。[0039]实施例2重组死亡素的诱导表达挑取实施例1中制备的表达死亡素的毕赤酵母细胞，接种于25mLBMGY培养基中，3TC，220rpin培养24小时制备一级种子液。[0040]取2〇mL—级种子液接种于2〇〇mLBMGY培养基中制备二级种子液，3TC，220rpm培养24小时。[0041]二级种子液全部接种于5L发酵罐（2LBSM培养基），控制温度30。0±0.5。：，溶氧20%±5%，pH=5.0±0.5。[0042]基础甘油耗尽后，流加10%甘油，甘油耗尽后直至溶氧突然上升，饥饿半小时，流加甲醇诱导死亡素表达，共诱导120小时，离心6000Xg，5min取发酵上清液进行检测。[0043]实施例3重组死亡素蛋白浓度检测和蛋白电泳用Bradford法测定实施例中的发酵液上清液总蛋白浓度，结果显示死亡素表达菌株诱导120小时发酵上清液的总蛋白浓度为〇.67gL。[0044]请参阅图3，TriCine-SDS-PAGE蛋白电泳分析发酵上清液死亡素含量的结果显示，发酵上清液蛋白电泳后在3〜6KD之间有目标大小的蛋白条带，蛋白条带的分子量大小与死亡素分子量相近，约为2.4KD;通过软件分析，死亡素蛋白含量90%以上。发酵上清液总蛋白浓度为〇.67gL，对应的死亡素蛋白含量达0•6gL，是公开报道的最高水平。[0045]实施例4重组死亡素的质谱检测将实施例3中蛋白电泳胶的目标条带切下来进行质谱分析，结果如图4所示;死亡素THA理论分子量为2435.97，质谱图在813•61mz，[M+3H]3+处有符合大小的目标峰，其对应分子量为2440.83，检测结果与预测结果相符，可初步判断毕赤酵母工程菌表达的物质是死亡素THA。[0046]实施例5重组死亡素抑菌圈检测请参阅图5，将指示菌大肠杆菌ATCC25922、K88和沙门氏菌接种于MH培养基制备指示菌液。用生理盐水稀释至〇D625=2•30D625，指某种溶液在625nm波长处的吸光值），取lOOiiL稀释指示菌液至100mLMH固体培养基温度50-55°C中，混匀，取10.5mL固体培养基至标准培养皿中，冷却凝固；利用打孔器打孔，每孔添加5yL发酵上清液，盖上陶瓦盖，置于37°C培养箱培养16小时，观察发酵上清液的抑菌效果，观察所得，制备的死亡素发酵液对大肠杆菌和沙门氏菌具有很好的抑菌效果。[0047]实施例6菌株稳定性评价通过连续传代培养评价菌株稳定性。[0048]挑取实施例2中所制备的表达死亡素的毕赤酵母细胞菌落接种于3mLBMGY培养基中，30°C，220rpm培养24小时制备种子液。[0049]取0•5mL种子液接种于25mLBMGY培养基中，3TC，220rpm培养24小时。[0050]菌液转移到50mL离心管中，离心6000Xg，5min弃去上清液，用25mL甲醇浓度为1%的BMMY培养基重悬菌体，菌液转移到250mL三角瓶中，30°C，220rpm培养72小时，每24小时添加甲醇至1%浓度;离心6000Xg，5min取发酵上清液进行死亡素的最低抑菌浓度检测MIC。[0051]挑取筛选菌株，连续传代培养10代，检测发酵上清液最低抑菌浓度，结果显示，每一代菌株的摇瓶发酵上清液的MIC=l200,说明菌株稳定性良好。[0052]综上所述，本发明采用毕赤酵母进行死亡素的分泌表达，实现了死亡素的大量表达，降低了生产成本;本发明所述的毕赤酵母生产菌株，死亡素最高表达量达到〇.6gL，是公开报道的最高水平，而且死亡素抗菌肽存在于发酵上清液中，不需要破碎细胞，只需要简单过滤出去菌体，即可得到杂蛋白很少的死亡素样品，便于后续死亡素的分离纯化，降低生产成本。本发明制备的死亡素样品，对大肠杆菌和沙门氏菌有显著的抑制作用。[0053]可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

权利要求：1.一种表达重组Thanatin抗菌肽的毕赤酵母，其特征在于，所述的重组Thanatin抗菌肽包括SEQIDNo.2所示的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的表达重组Thanatin抗菌肽的毕赤酵母，其特征在于，所述的毕赤酵母包括毕赤酵母X33、毕赤酵母GS115和毕赤酵母SMD1168中的一种。3.根据权利要求2所述的表达重组Thanatin抗菌肽的毕赤酵母，其特征在于，所述的毕赤酵母为毕赤酵母X33。4.根据权利要求1所述的表达重组Thanatin抗菌肽的毕赤酵母，其特征在于，所述的表达重组Thanatin抗菌肽的载体骨架为pPICzaA。5.根据权利要求4所述的表达重组Thanatin抗菌肽的毕赤酵母，其特征在于，所述的Thanatin抗菌肽的表达载体为pPICzaA-THA。6.根据权利要求5所述的表达重组Thanatin抗菌肽的毕赤酵母，其特征在于，所述的表达载体pPICzaA-THA的构建包括以下步骤：8001、在1^1^1:111抗菌肽的基因5’端添加\11〇1酶切位点和16\2切割位点CTCGAGAMAGA,在Thanatin抗菌肽的基因3’端添加XbaI酶切位点TCTAGA，合成后得到克隆载体pUC-THA;5002、XhoI和Xbal限制性内切酶双酶切处理步骤S001中得到的pUC-THA克隆载体，得到Thanatin基因片段；5003、将步骤S002中得到的Thanatin基因片段连接至同样被Xhol和Xbal限制性内切酶双酶切处理的pPICzaA载体，构建得到表达载体pPICzaA-THA。7.根据权利要求5所述的表达重组Thanatin抗菌肽的毕赤酵母，其特征在于，所述的表达载体pPICzaA-THA菌株的验证引物为：5A0X-F:5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’，3A0X-R:5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’。8.根据权利要求1所述的表达重组Thanatin抗菌肽的毕赤酵母，其特征在于，所述的重组Thanatin工程菌的筛选抗生素为0•25-4mgmL的博来霉素。9.根据权利要求1所述的表达重组Thanatin抗菌肽的毕赤酵母，其特征在于，所述重组Thanatin抗菌肽的诱导表达方法包括以下步骤：5004、制备种子液:挑选如权利要求1-8所述的表达重组Thanatin抗菌肽的毕赤酵母细胞，接种于25mLBMGY培养基中，30°C，220rpm培养24小时制备得到一级种子液;取20mL—级种子液接种于200mLBMGY培养基中，30°C，220rpm培养24小时制备得到二级种子液；5005、发酵培养:将步骤S004中制备的二级种子液全部接种于5L发酵罐中，加入2LBSM培养基，控制温度30°C±0.5°C，溶氧20%±5%，PH为5.0±0•5;5006、饲喂碳源:步骤S005的培养基中的甘油耗尽后，流加10%甘油；5007、甲醇诱导:步骤S006的培养基中的甘油耗尽后，直至溶氧突然上升，饥饿半小时，流加甲醇诱导Thanatin表达，共诱导120h。10.根据权利要求1-9任一项所述的表重组Thanatin抗菌肽的毕赤酵母，其特征在于，其保藏编号为CDMCCNo:60261。

百度查询： 广东海纳川生物科技股份有限公司 一种表达重组Thanatin抗菌肽的毕赤酵母

免责声明
1、本报告根据公开、合法渠道获得相关数据和信息，力求客观、公正，但并不保证数据的最终完整性和准确性。
2、报告中的分析和结论仅反映本公司于发布本报告当日的职业理解，仅供参考使用，不能作为本公司承担任何法律责任的依据或者凭证。

阅读全文 双屏查看 官方信息 专利公告 收藏专利 下载PDF 下载WORD