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申请/专利权人：山西大学

摘要：本发明公开一种转染Jurkat细胞的方法，步骤包括：将0.1mgmL多聚‑D‑赖氨酸加入24孔细胞培养板，4度静置过夜，吸出液体，超净台内开盖吹干，用PBS洗；向上述培养板接种Jurkat细胞，培养箱中培养，次日移除上清，用PBS洗3次，Jurkat细胞转为“贴壁”状态；按照贴壁细胞转染的常规步骤转染pLL3.7质粒，转染24小时后荧光显微镜下观察GFP的表达量，确定转染效率。本发明对Jurkat细胞进行“贴壁”处理后，可加大脂质体复合物与细胞的接触机会，有效提高转染效率90％以上。本发明贴壁处理过程不影响细胞活力，可以对Jurkat细胞安全的转染外源质粒。

主权项：一种转染Jurkat细胞的方法，其特征在于包括以下步骤：a.向24孔板内加入150～500μL含有0.1mgmL多聚‑D‑赖氨酸的PBS，向24孔板的另外一孔加入150～500μL PBS作为对照组，4度冰箱静置过夜；b.吸掉上清，PBS洗3～5次，将0.5～1.5×106个Jurkat细胞重悬于500μL含有10％的新生牛血清且不含抗生素的RPMI1640培养基，在37度、5％CO2培养箱内培养10～16小时，然后吸掉未贴壁的细胞，用PBS洗3次，加入200～500μL PBS显微镜下观察Jurkat细胞贴壁情况计算相对贴壁率；c.当相对贴壁率大于3时，按照贴壁细胞的转染方法，用3～9μL的脂质体2000转染1～3μg的含有GFP表达序列的pLL3.7质粒，转染后4～6小时，更换含有10％的新生牛血清的RPMI1640培养基，24小时后荧光显微镜下观察GFP的表达情况，计算转染效率。

全文数据：一种转染Jurkat细胞的方法技术领域[0001]本发明涉及生物技术领域，具体属于一种转染Jurkat细胞的方法。背景技术[0002]外源基因转移是一种运用物理、化学或生物学的方法将外源基因转移到受体细胞内，并使之在胞内实现基因扩增和表达的技术，已广泛应用于现代生命科学研宄和临床医学基因治疗中。常用的外源基因转移策略主要采用磷酸钙沉淀法、DEAE-葡萄糖法和脂质体转染法等，尤其是脂质体转染法受到了广泛推广。然而，脂质体法仅适用于贴壁细胞，对悬浮细胞难以获得令人满意的转染效率。目前悬浮细胞转染主要采用电穿孔技术，不仅需要特定的电转仪，而且对细胞损伤较大、难以保证细胞活力。慢病毒和腺病毒介导的转染技术虽然在一定程度上解决了转染效率低的问题，然而操作过程繁琐、安全风险大、应用于基因治疗容易引起严重的免疫反应。因此，如何在高效转染悬浮细胞的同时保证细胞活力成为以悬浮细胞为材料研宄靶基因特定功能的一个亟待解决的问题。[0003]Jurkat细胞来源于急性T-淋巴细胞白血病患者的外周血，属于悬浮细胞，是研宄急性T-淋巴细胞白血病发病机制和治疗药物中应用最广泛的细胞系之一。现有的转染方法，如脂质体转染、钙转和电击转染等方法转染Jurkat细胞普遍存在转染效率低、细胞活力差的问题，这就大大限制了Jurkat细胞在白血病机制研究和药物研发中的应用。因此，找到高效且安全的转染方法，是以Jurkat细胞为材料研宄T淋巴细胞白血病的发病机制和靶向治疗白血病的技术难题。[0004]赖氨酸是一种带正电荷的氨基酸，分子量大于7〇KD的多聚赖氨酸可以用于促进细胞贴壁生长。多聚-D-赖氨酸和多聚-L-赖氨酸都可以用于促进细胞的贴壁。李墨林等在2〇12年10月10日公开的方法中用到lmgmL的多聚-L-赖氨酸处理细胞培养板并增加了悬浮细胞脂质体转染的转染效率。但是，此方法不适用于Jurkat细胞。原因是多聚-L-赖氨酸可以被细胞消化并吸收，摄入过多的多聚-L-赖氨酸会产生一定的细胞毒性，且使用的浓度很大（lmgmL，造成了试剂的浪费。发明内容[0005]本发明的目的在于提供一种转染效率高、安全的转染Jurkat细胞的方法。[0006]本发明提供的一种转染Jurkat细胞的方法，包括以下步骤：[0007]a•向24孔板内加入150〜5〇OyL含有O.lmgmL多聚-D-赖氨酸的PBS，向24孔板的另外一孔加入150〜5〇OyLPBS作为对照组，4度冰箱静置过夜;所述多聚赖氨酸分子量为150〜300KD;[0008]b.吸掉上清，PBS洗3〜5次，将0•5〜1•5X1〇6个Jurkat细胞重悬于5〇〇此含有10%的新生牛血清且不含抗生素的RPMI1640培养基，在37度、5%C02培养箱内培养10〜16小时，然后吸掉未贴壁的细胞，用PBS洗3次，加入200〜5〇〇uLPBS显微镜下观察jurkat细胞贴壁情况计算相对贴壁率；[0009]C•当相对贴壁率大于3时，按照贴壁细胞的转染方法，用3〜9uL的脂质体2000转染1〜3yg的含有GFP表达序列的pLL3.7质粒，转染后4〜6小时，更换含有1〇%的新生牛血清的RPMI1640培养基，24小时后荧光显微镜下观察GFP的表达情况，计算转染效率。[0010]用0•lmgmL的多聚-D-赖氨酸与1•5X106个Jurkat细胞作用38〜46小时，MTT法测细胞活力，无显著影响。[0011]与现有技术相比，本发明的有益效果：[0012]1本发明用分子量为lf5〇〜300KD的多聚-D-赖氨酸提前包被24孔细胞培养板后接种Jurkat细胞，将悬浮的Jurkat细胞变成“贴壁”细胞，再利用脂质体2000进行转染，克服了Jurkat细胞难转染的问题，转染效率达90%以上。[0013]2另外，在转染过程所经历的42小时内，低浓度的多聚-D-赖氨酸（0•lmgL对Jurkat细胞的活力无显著影响。因此，本发明提供了一种能高效无毒的传递DNA进入Jurkat细胞的方法。此方法可为研究T淋巴细胞白血病的发病机制和靶向治疗提供技术支持。附图说明[0014]图1本发明实施案例1相对贴壁率统计结果[0015]图2本发明实施案例1转染效率统计结果[0016]图3本发明实施案例1细胞活力检测结果具体实施方式[0017]实施例1一种转染Jurkat细胞的方法，包括以下步骤：[0018]a•向24孔板内加入150UL含有0.1mgmL多聚-D-赖氨酸的PBS，向24孔板的另外一孔加入150uLPBS作为对照组，4度冰箱静置过夜。[0019]b•吸掉上清，PBS洗3次，将1•5X1〇6个Jurkat细胞重悬于500UL含有10%的新生牛血清且不含抗生素的RPMI1640培养基，在37度、5%C〇2培养箱内培养12小时。然后吸掉未贴壁的细胞，用洗3次，每次洗5分钟，加入300uLPBS显微镜下观察Jurkat细胞贴壁情况图1。随机选取8个视野，记录每个视野的细胞数，每组的细胞数除以对照组的细胞数，得出相对贴壁率。[0020]c.当相对贴壁率大于3时，按照贴壁细胞的转染方法，用脂质体20003此转染含有GFP表达序列的pLL3•7质粒（lyg，转染后6小时，更换含有10%的新生牛血清的RPMI1640培养基，24小时后荧光显微镜下观察GFP的表达情况，计算转染效率（图2。转染效率计算方法为，细胞转染24小时后随机选取10个视野，每个视野选定后分别在蓝光和可见光下拍照，计数各个视野内发绿色荧光的细胞数A1，A2，A3,……，A10和细胞总数B1，B2，[0021]B3,……，B10,用A1B1，……，A10B10的平均值土SD做统计分析并做图得到转染效率。[0022]用0•lmgmL的多聚-D-赖氨酸的PBS与1.5X1〇6个Jurkat细胞作用42小时，MTT法测细胞活力（图3oPBS为对照组，即用等体积的PBS包被细胞培养板。经过t-test检测得出结论0.lmgmL多聚-D-赖氨酸对Jurkat细胞活力无显著影响。

权利要求：1.一柙转染Jurkat细胞的方法，其特征在于包括以下步骤：a•向24孔板内加入150〜_此含有〇.lmgmL多聚—D—赖氨酸的pBS，向於孔板的另外一孔加入150〜500uLPBS作为对照组，4度冰箱静置过夜；’b•吸掉上清，PBS洗3〜5次，将0•5〜1•5X1〇6个jurkat细胞重悬于500tlL含有1〇%的新生牛血清且不含抗生素的RPMI1_培养基，在37度、5%C〇2培养箱内培养1〇〜16小时，然后吸掉未贴壁的细胞，用PBS洗3次，加入200〜500uLPBS显微镜下观察jurkat细胞贴壁情况计算相对贴壁率；c•当相对贴壁率大于3时，按照贴壁细胞的转染方法，用3〜9uL的脂质体2000转染1〜3郎的含有GFP表达序列的pLL3.7质粒，转染后4〜6小时，更换含有1〇%的新生牛血清的RPMI1640培养基，24小时后荧光显微镜下观察GFP的表达情况，计算转染效率。2.如权利要求1所述的一种转染Jurkat细胞的方法，其特征在于所述多聚-D-赖氨酸分子量为150〜300KD。

百度查询： 山西大学 一种转染Jurkat细胞的方法