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申请/专利权人：天津科美生物技术有限公司

摘要：本发明涉及分子检测技术领域，尤其涉及microRNA检测和治疗前列腺癌PCa的方法。本发明提供了miR‑203SNAI2轴对前列腺癌的体外及体内生物学特性的影响。具体的，在DU145和PC3细胞中表达miR‑203降低血管生成，通过表达miR‑203和SNAI2可改善miR‑203的抑制作用。miR‑203抑制了前列腺癌细胞的内皮细胞形成和血管的生成。

主权项：1.一种利用miR-203SNAI2轴诊断和治疗前列腺癌的方法。

全文数据：一种利用miR-203SNAI2轴调节前列腺肿瘤血管生成的方法技术领域本发明涉及分子检测技术领域，尤其涉及microRNA检测和治疗前列腺癌PCa的方法。本发明提供了miR-203SNAI2轴可作为PCa的诊断和治疗靶点。背景技术近年来前列腺癌Prostatecancer，PCa的发病率和死亡率急剧上升，其增长率位居肿瘤之首。同时，PCa的防治面临着两大临床难题，即早期诊断指标特异性差和晚期治疗方法效果不佳。前列腺癌的发生和进展是涉及多基因突变和基因调控异常的多步过程。越来越多的证据表明，特定基因调控异常，包括microRNAsmiRNAs和长链非编码RNAlncRNAs，是PCa的发病和发展的主要原因。尽管如此，在PCa中miRNAs和lncRNAs之间的交叉效应仍然不是很清楚。研究发生在PCa中的miRNA-lncRNA的效应机制不仅可以提高我们对PCa的认知，也将有助于确定治疗PCa的靶点。越来越多的证据表明，miR-203参与多种生理和病理过程，包括上皮分化、癌细胞增殖、转化和凋亡。有趣的是，不同的文献表明，miR-203参与GSK3ββ-CATENIN通路。例如，AnnieZhang等人报道，miR-203抑制了与PIK3CA、p38MAPK、c-Jun和GSK-3信号信号相关的肝癌的增殖。在黑素瘤细胞中，β-catenin抑制miR-203转录。另一方面，在我们之前的论文中，我们已经证明，miR-203在转移性乳腺癌细胞中通常是表观沉默的，而miR-203的下调则与靶向SNAI2密切相关。在此之后，其他实验室的一些研究也表明，miR-203SNAI2轴在不同类型的癌症中起着关键作用，包括卵巢癌、胶质母细胞瘤和乳腺癌。尽管易瞿等人报道，miR-182和miR-203的表达在从正常前列腺上皮EP156T细胞到子代非转换EPT1间质细胞的上皮间质转变EMT过程中被压抑，而miR-182和miR-203在正常前列腺上皮细胞的过表达可以通过调节SNAI2的表达诱导间质到上皮的转变MET，但是，miR-203SNAI2轴对肿前列腺癌细胞，包括细胞增殖、迁移、血管生成、具备干细胞、异种移植生长和相关信号通路等的关键作用，并没有相关的记录和报道。在本研究中，我们旨在阐明miR-203SNAI2轴在前列腺肿瘤血管生成中的确切作用。结果表明，miR-203SNAI2轴可以调控肿瘤发生和血管生成，miR-203在肿瘤细胞中的表达显著降低了干细胞的生长，其抑制作用可以通过转染pSIN-SNAI2减弱。这些发现为miR-203和SNAI2在恶性肿瘤细胞的诊断和治疗提供了新的理论依据和可能性。发明内容本发明确定了miR-203SNAI2轴在体内和体外都与肿瘤血管生成有关。血管生成在包括肿瘤进展在内的生理和病理过程中起着至关重要的作用。为了进一步检验miR-203轴在血管生成中的作用，我们确定了在DU145和PC3细胞中miR-203和SNAI2表达的变化是否直接调节内皮细胞的行为，如管形成，这是血管生成的标志。我们从有效地过表达了miR-203的DU145和PC3细胞中收集了条件培养基，并将其应用到HuVECs中用于血管形成实验。结果表明，在PC3和DU145细胞中，miR-203的异位表达显著降低了HuVECs中的累积管长，而pSIN-SNAI2的转染则可以改善miR-203的抑制作用图1A和1B。与此同时，在体内异种移植模型中，通过过度表达miR-203可以明显降低异种移植组织中微血管的数量，SNAI2的再表达可以部分逆转miR-203诱导的抑制效应图1C和1D。附图说明图1miR-203SNAI2轴在体内和体外都与肿瘤血管生成有关。A和B。（A）为使用指示组的条件培养基进行的HuVECs中的血管形成实验。对于血管形成实验，用ImageJ软件测量管长B，每单位为100像素。C和D。H&E染色显示血管如箭头指示。所有数据均通过t检验进行统计分析。不同的字母表示差异具有统计学意义p0.05。具体实施方式1.细胞培养5个前列腺癌细胞株DU145、PC3、22Rv1、LNCaP和C4-2和2个永生化和未转化的前列腺上皮细胞系PZ-HPV-7和RWPE1从美国ATCC获得。细胞按照ATCC的标准手册进行培养。人类脐静脉内皮细胞（HuVECs）购买于LifeTechnologiesCarlsbad，California，USA，根据说明书进行培养。2.在HuVECs中的血管形成实验经过处理的细胞被接种到6孔板中。增长到90%后，细胞用PBS洗了三次，然后用含1%血清的500μl培养基培养24h。之后培养基在1500rpm离心，收集上清液。总共5×104个HuVECs细胞用缺少生长因子的基质胶接种到48孔板的每个孔中。培养了8h后添加之前收集的培养基或HuVEC培养基，使用显微镜捕捉毛细血管状的结构，使用ImageJ软件在10×视野中通过测量积累管长度来评估血管形成实验。至少选择5个视野来确定细胞管的形成能力。3.H&E染色以4%多聚甲醛PFA对异种移植组织进行了30min的采收和固定，并在加入石蜡前进行了乙醇梯度脱水。嵌入式的石蜡样本被切割5μm并安装到载玻片上。然后将这些切片用苏木素和伊红染色，并用显微镜在亮视野下拍照。

权利要求：1.一种利用miR-203SNAI2轴诊断和治疗前列腺癌的方法。2.根据权利要求1所述，其特征在于，转染miR-203减少了DU145和PC3细胞血管的形成。3.根据权利要求2所述，其特征在于，与只转染pSIN-miR-203p0.05相比，pSIN-miR-203和pSIN-SNAI2共同转染后细胞血管的形成增加。4.根据权利要求2所述，其特征在于，在体内异种移植模型中，通过过度表达miR-203可以明显降低异种移植组织中微血管的数量。5.根据权利要求3所述，其特征在于，在体内异种移植模型中，通过过度表达miR-203可以明显降低异种移植组织中微血管的数量，SNAI2的再表达可以部分逆转miR-203诱导的抑制效应。

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