申请/专利权人：张曼

申请日：2018-12-04

公开（公告）日：2019-09-20

公开（公告）号：CN110257336A

主分类号：C12N5/10(20060101)

分类号：C12N5/10(20060101);C12N15/867(20060101);C12N15/113(20100101);C12R1/91(20060101)

优先权：["20180312 CN 2018102018578"]

专利状态码：有效-授权

法律状态：2022.07.01#授权;2019.10.22#实质审查的生效;2019.09.20#公开

摘要：本发明提供一种慢病毒感染人前列腺癌细胞株（PC‑3）敲除内源性基因，并成功建立稳筛细胞株。具体是利用FTH‑shRNA慢病毒感染PC‑3细胞株沉默FTH（铁蛋白重链）表达，成功建立FTH敲低PC‑3细胞株。本发明通过研究证实FTH敲低PC‑3细胞株可稳定沉默FTH表达并传代。与阴性对照相比，敲低FTH后的PC‑3细胞株中FTH蛋白表达水平显著下降，细胞增殖能力和迁移能力显著降低。

主权项：1.一种FTH敲低的PC-3细胞株，其特征在于，其保藏编号为CGMCCNO:16897。

全文数据：一种FTH敲低的人前列腺癌细胞株技术领域本发明涉及慢病毒感染人前列腺癌细胞株（PC-3）敲除内源性基因，并成功建立稳筛细胞株。具体是利用FTH-shRNA慢病毒感染PC-3细胞株沉默FTH（铁蛋白重链）表达，成功建立FTH敲低PC-3细胞株。背景技术前列腺癌在西方国家男性高发的恶性肿瘤中，其死亡率高，居癌症死亡率的第二位，仅次于肺癌，近年来，随着人们生活方式的改变、人口的老龄化以及诊断水平的不断提升，我国前列腺癌的发病率呈明显上升趋势，成为严重危害我国男性身体健康的重要疾病之一。自20世纪90年代起，前列腺癌的实验研究在我国受到重视并迅速开展，然而人们对雄激素非依赖阶段前列腺癌及晚期前列腺癌的相关发病机制知之甚少，目前尚无有效的治疗方法，当前的研究仍然处于摸索阶段，还需要通过大量的体内外实验进行深入的探索。铁蛋白主要存在于肝脏、脾脏和大脑的锥体外侧束的细胞核中，是铁在体内较为稳定的贮存形式。由功能不同的亚型：铁蛋白轻链（FTL）组成和铁蛋白重链（FTH）。FTL缺乏酶活性，即L亚型，相对分子质量为19000；FTH具有酶活性，即H亚型，相对分子质量21000，可以将二价铁氧化成三价铁。铁蛋白参与多种疾病过程，目前大量临床和流行病学研究发现，体内铁蛋白储存量增高可能与罹患肝癌、肺癌、结肠癌、食管癌、胃肠道肿瘤、胰腺癌、乳腺癌有关，特别是当肝癌AFP测定值较低时，可测定铁蛋白浓度作为补充，以提高诊断效率。铁蛋白H亚型可抵制免疫反应，有助于癌细胞的生长和扩散。在多数肿瘤组织中，铁蛋白水平高于正常组织。肿瘤基因治疗领域的新技术—RNA干扰（RNAinterference，RNAi），是由双链RNA引发的转录后基因沉默现象（post-transcriptionalgenesilencing，PTGS），因其抑制效果确切、高特异性、高效性等特点而被广泛应用。以病毒载体形式表达的短发夹RNA（shorthairpinRNA，shRNA），通常是利用RNA聚合酶Ⅲ启动子（人或鼠U6或人H1启动子）转录下游反向重复DNA序列，形成小发夹结构，被Dicer等酶识别而切割成小干扰RNA（smallinterferingRNA，siRNA），进而稳定而特异地沉默基因，是发挥RNAi的有效方式。RNAi是研究基因功能、基因治疗的重要工具,目前已应用于恶性肿瘤、病毒感染性疾病基因治疗的研究。与腺病毒、逆转录病毒等其它病毒载体系统相比，慢病毒Lentivirus不仅能转导分裂细胞，还能转导非分裂期细胞，将外源性基因整合到靶细胞的基因组当中，从而实现对靶细胞中的目的基因稳定、持续的沉默。选用慢病毒做为载体系统来研究RNAi对细胞中基因的干扰过程具有巨大的潜力和明显的优势。PC-3细胞株是从前列腺癌骨转移肿瘤中分离出来的细胞株，分化程度低，为雄激素非依赖性前列腺癌细胞，不含有内源性的雄激素受体，具有中等强度的转移潜能，被广泛于雄激素抵抗型的前列腺癌的研究。近年来针对铁蛋白研究较多的肿瘤主要为卵巢癌、乳腺癌及肝癌，对前列腺癌中的研究尚且不足。因此，我们利用RNAi技术用FTH重组表达载体感染PC-3细胞建立FTH敲低的PC-3细胞模型，为研究FTH在前列腺癌早期诊断和基因治疗中应用提供了有力的实验材料。发明内容本发明涉及慢病毒感染人前列腺癌细胞株（PC-3）敲除内源性基因，并成功建立稳筛细胞株。通过应用RNAi技术，利用FTH-shRNA感染PC-3细胞，建立FTH敲低的PC-3细胞株，再利用免疫细胞荧光、qRT-PCR和Westernblot技术对细胞株进行检测，证明细胞株建立成功。其保藏编号为CGMCCNO:16897，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，北京中国科学院微生物研究所，保藏时间为2018年12月03日。本发明通过下述技术方案实现：a构建含有碱基序列SEQIDNO：1的重组表达载体；b利用如步骤a获得的重组表达载体分别感染宿主细胞PC-3得到感染细胞株；c将步骤b所得重组细胞株经过Puromycin筛选培养基培养，每3～5天更换一次筛选培养基，筛选2个月，获得阳性细胞株，并以半药浓度持续维持；其中，所述的Puromycin筛选培养基为10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中，加入Puromycin使其终浓度为2μgml；d）将步骤（c）筛选所得的阳性细胞，培养瓶中细胞生长至80%～90%汇合率时，收集细胞，提取RNA和蛋白质，利用免疫细胞荧光、qRT-PCR、Westernblot、Transwell试验和克隆形成试验检测FTH的表达阳性细胞株。其检测结果为：与PC-3细胞株相比，阳性细胞株中有98％以上的细胞表达绿色荧光蛋白，阳性细胞株中FTH的蛋白表达量为PC-3细胞的0%，细胞增殖能力和迁移能力显著降低。为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。附图说明图1：建立FTH敲低的细胞株荧光显微图。图2：RT-PCR法对细胞株中的FTH进行检测图。图3：Westernblot法对细胞株中的FTH进行检测图。图4：Transwell试验检测FTH敲低细胞迁移能力图。图5：克隆形成试验检测FTH敲低细胞增殖能力图。具体实施方式下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明；FTH-shRNA慢病毒载体：上海吉凯基因化学技术有限公司；阴性对照（NC）慢病毒载体：上海吉凯基因化学技术有限公司；Puromycin：sigma公司；RPMI-1640培养基（粉剂）：美国Gibco公司；0.05％胰蛋白酶：美国Genview公司；胎牛血清：北京鼎国生物技术公司；增强型HRP-DAB底物显色试剂盒：北京鼎国生物技术公司；FTH兔抗人多克隆抗体：美国abcam公司；抗β-actin抗体：北京中杉金桥生物技术公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体：北京鼎国生物技术公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠抗体：北京鼎国生物技术公司。实施例1FTH-shRNA慢病毒载体感染PC-3细胞（a）将处于对数期生长的PC-3细胞以4×104个细胞ml的浓度接种入96孔板中，置于10%胎牛血清RPMI-1640培养基中，37℃，5%CO2饱和度培养箱中过夜培养24h，使感染时每孔细胞融合度30%左右；（b）稀释病毒，最终以MOI值10感染细胞，取出铺好板的细胞，弃去旧培养基，迅速加入稀释病毒液100μl孔，10%胎牛血清RPMI-1640培养基，37℃，5%CO2饱和度培养箱中培养8-16小时后更换为正常培养基；（c）感染72-96小时后，观察GFP表达情况，必要时可进行传代。实施例2阳性细胞株的筛选（1）将重组细胞株加入含2μgmLPuromycin，10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，2～3天更换一次筛选培养基，筛选培养2个月；（2）在10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中加入Puromycin的终浓度为1μgmL，在37℃的5％CO2培养箱中维持筛选，每3～5天更换上述培养基。实施例3阳性细胞株的检测1.免疫细胞荧光对细胞株中FTH进行检测细胞荧光检测：由于感染的质粒中带有绿色荧光蛋白（GFP）基因，感染成功后即可以在荧光显微镜下观察到GFP。荧光显微镜下观察PC-3细胞、及分别经空载体（NC）、FTH-shRNA慢病毒感染的PC-3细胞的情况，从图1中可见，上方三张分别为PC-3对照、NC感染PC-3细胞、FTH-shRNA感染PC-3细胞的显微镜图，下方三张分别为PC-3对照、NC感染PC-3细胞、FTH-shRNA感染PC-3细胞的荧光显微镜图。对照组细胞没有感染慢病毒，因此无GFP表达；NC组PC-3细胞成功感染了空载体，发现感染的细胞株中有GFP表达，荧光显微镜下呈现绿色荧光；感染FTH-shRNA的PC-3细胞，发现细胞株中有GFP表达，荧光显微镜下呈现绿色荧光，证明感染成功。2.qRT-PCR技术检测FTH基因表达（a）RNA的提取：将受试样品细胞用PBS洗两次，加1mlTrizol，静置10min后吹打直至细胞充分裂解。裂解液中加入氯仿（每使用1mlTrizol加0.2ml氯仿），剧烈振荡15s，室温静置5min；12,000g，4℃离心15min；取出离心管，样品分为三层：无色的上清水相、中间的白色层及粉红色的下层有机相。小心吸取无色上清水相移至另一EP管，并加入等体积的异丙醇，轻轻混匀，-20℃静置10min；12,000g，4℃离心10min；小心去除上清，缓慢沿管壁加入75％的乙醇洗涤沉淀两次。12,000g，4℃离心5min；小心吸尽上清；室温干燥沉淀10min，加入20μl的无RNase水溶解RNA沉淀，待完全溶解后于-80℃保存；（b）RNA浓度和纯度的测定：取RNA样本用DEPC水稀释100倍后，测A260A280值和RNA浓度，注意OD260OD280应控制在1.7-2.0之间较为理想；（c）RT-PCR反应实验：RT反应（20μl体系）：①取灭过菌且无核酸酶的PCR管，依次加入RNA（2μg）、OligodT1μl、用DEPC水补足8ul；②70℃水浴5min，然后置于冰上冷却1min以上；③往步骤①中的PCR管依次加入下列组份：RNase抑制剂1μl、5xRTbuffer5μl、dNTPs5μl、逆转录酶（AMV）1μl；④先在42℃金属浴60min，然后70℃保温5min，然后置于冰上至少1min；（d）PCR反应：取灭过菌且无核酸酶的PCR管，在冰上依次加入：模板1μl、上下游引物各0.4μl、Mix10μl、DEPC水8.2μl，充分混匀，加盖后离心。PCR扩增条件：第一阶段：95℃×5min，1个循环；第二阶段：95℃×10s、55℃×10s、72℃×10s，45个循环；第三阶段：95℃×5s、65℃×1min、97℃持续，1个循环；第四阶段：40℃×30s，1个循环。反应结束后，对结果进行分析。图2为qRT-PCR检测感染后PC-3细胞中FTH的表达，FTH-shRNA感染组细胞中FTH的表达低于对照组，FTH表达量为PC-3细胞的3.3%。3.WesternBlot检测FTH蛋白表达变化利用WesternBlot检测发现有蛋白印迹的条带，即为细胞株中存在FTH表达，蛋白印迹的条带变淡即为FTH敲低成功。不同组细胞分别用PBS冲洗两次，加入细胞裂解液，得到细胞全蛋白，应用日立7600全自动生化仪测定全细胞蛋白质的浓度。12%SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，5%脱脂奶粉室温封闭2h，加入相应一抗：FTH（1：10000）、β-actin（1：1000）4℃，过夜，室温PBST洗PVDF膜，与含HRP标记的二抗，于室温平缓摇动孵育90min，HRP标记山羊抗兔和山羊抗鼠IgG均用5%脱脂奶粉以1：1000稀释，PBST溶液洗PVDF膜3次，DAB显色。扫描仪和凝胶成像系统记录相应条带的积分光密度值。图3.为WesternBlot检测感染后PC-3细胞中FTH的表达，FTH-shRNA感染组细胞中FTH的表达低于对照组，FTH表达量为PC-3细胞0%；提示FTH敲低的PC-3细胞株建立成功，可以用于其他实验研究。4.Transwell试验检测FTH敲低细胞迁移能力在24孔板Transwell上室中接种200ul含3％FBS培养基的3×105ml的感染后细胞，下室加入500µl10％FBS培养基，避免产生气泡。于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱内孵育24h后，用棉签擦去上室内的细胞，用PBS小心洗涤一次，10％甲醇溶液固定细胞15分钟，用0.1%结晶紫染色20分钟。轻轻甩去染色液，用PBS洗涤各孔，晾干，400倍显微镜下计数10个视野内的细胞数。图4.TRANSWELL实验结果显示，24h后400倍显微镜下计数10个视野内的细胞数，FTH-shRNA感染组细胞数为3±1.5，低于阴性对照组的33±3，P＜0.05；差异具有统计学意义。5.克隆形成试验检测FTH敲低细胞增殖能力将感染后细胞接种200个细胞孔到6孔培养板中，种细胞接种3孔，十字形轻轻晃动培养板，使细胞分散均匀，37°C、5%C02培养箱中培养2周。出现肉眼可见的细胞克隆时，终止培养，弃去培养液，用PBS液洗2次,空气干燥；甲醇固定15分钟，弃甲醇后空气干燥；用0.1%结晶紫染色20分钟，流水缓慢洗去染液，空气干燥；在显微镜下对形成的克隆计数≥50个细胞为一个克隆，平板克隆形成率=（克隆数接种细胞数）×100%，实验重复3次。图5克隆形成实验结果表明，FTH-shRNA感染组克隆形成率0.05±0.01，低于阴性对照组的克隆形成率0.24±0.01，P＜0.01。序列表张曼一种FTH敲低的人前列腺癌细胞株201810201857.82018-03-124SIPOSequenceListing1.0119DNAFTH序列sh-RNADNA正义链shRNA1tgtccatgtcttactactt19219DNAFTH序列sh-RNADNA反义链shRNA2acaggtacagaatgatgaa19319DNA阴性对照正义链DNA3ttctccgaacgtgtcacgt19419DNA阴性对照反义链DNA4aagaggcttgcacagtgca19

权利要求：1.一种FTH敲低的PC-3细胞株，其特征在于，其保藏编号为CGMCCNO:16897。2.根据权利要求1，其特征在于，所述细胞株的构建方法如下：a构建含有碱基序列SEQIDNO：1的重组表达载体；b利用如步骤a获得的重组表达载体感染宿主细胞PC-3得到感染细胞株；c将步骤b所得感染细胞株经过Puromycin筛选培养基培养，每3～5天更换一次筛选培养基，筛选2个月，获得阳性细胞株，并以半药浓度持续维持；其中，所述的Puromycin筛选培养基为10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中，加入Puromycin使其终浓度为2μgml。3.根据权利要求1，其特征在于，所述细胞株可稳定沉默FTH表达并传代。4.根据权利要求1，其特征在于，所述细胞株中FTH蛋白表达水平显著下降，细胞增殖能力和迁移能力显著降低。

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