申请/专利权人：西南民族大学

申请日：2017-03-27

公开（公告）日：2019-10-25

公开（公告）号：CN106950305B

主分类号：G01N30/02(20060101)

分类号：G01N30/02(20060101);G01N30/90(20060101)

优先权：

专利状态码：失效-未缴年费专利权终止

法律状态：2022.03.11#未缴年费专利权终止;2017.08.08#实质审查的生效;2017.07.14#公开

摘要：本发明提供了红牛膝的检测方法，它是采用UPLC检测方法实现的。本发明首次使用3‑O‑[α‑L‑吡喃鼠李糖1→3‑β‑D‑吡喃葡萄糖醛酸]‑齐墩果酸‑28‑O‑β‑D‑吡喃葡萄糖作为检测红牛膝的指标成分，本发明采用UPLC对红牛膝中的该成分进行检测，具有良好的稳定性、重现性，并且本发明检测方法能够有效将该成分与其他成分分离，不仅能够达到对该成分的定性，还可以同时满足定量检测的需求。

主权项：1.红牛膝的检测方法，其特征在于：它包括如下操作：1取红牛膝，以含水或不含水的醇类溶剂提取，提取液浓缩至无醇味，以石油醚-水两相溶剂进行脱脂，剩余水相再用正丁醇萃取，取正丁醇相，除去正丁醇后，使用适当溶剂制备供试品溶液；2取3-O-[α-L-吡喃鼠李糖1→3-β-D-吡喃葡萄糖醛酸]-齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖，使用适当溶剂制备对照品溶液；3将供试品溶液和对照品溶液经超高效液相色谱法检测，即可实现定性或定量检测；其中，色谱条件如下:色谱柱：填料为C18，尺寸为2.1×50mm，1.7μm流动相：乙腈-磷酸水溶液，洗脱程序为：

全文数据：红牛膝的检测方法技术领域本发明涉及中药材质量检测领域，具体涉及红牛膝的检测方法。背景技术红牛膝，为四川凉山彝族自治州、云南楚雄彝族自治州、贵州等彝族地区的彝医临床常用药材，在凉山彝族自治州，称为勒死补你或乃死补你为苋科植物头花杯苋CyathulaCapitataWall.Moq.的根，用于治疗跌打损伤、风湿、类风湿等疾病。国内外对牛膝类药材的研究主要集中在中医临床上常用的牛膝AchyranthesbidentataBlume与川牛膝CyathulaofficinalisKuan；红牛膝的相关研究较少。红牛膝作为四川凉山彝族自治州、云南楚雄彝族自治州、贵川等彝族地区的彝医临床常用药材，目前尚未建立药材和成方制剂的质量标准，这极不利于红牛膝药材的临床应用的安全、有效和质量可控。发明内容本发明目的在于首次提供一种对红牛膝的检测方法。具体地，本发明提供了红牛膝的检测方法，它包括如下操作：1取红牛膝，以含水或不含水的醇类溶剂提取，提取液浓缩至无醇味，以石油醚-水两相溶剂进行脱脂，剩余水相再用正丁醇萃取，取正丁醇相，除去正丁醇后，使用适当溶剂制备供试品溶液；2取3-O-[α-L-吡喃鼠李糖1→3-β-D-吡喃葡萄糖醛酸]-齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖，使用适当溶剂制备对照品溶液；3将供试品溶液和对照品溶液经超高效液相色谱法检测，即可实现定性或定量检测；其中，色谱条件如下:色谱柱：填料为C18，尺寸为2.1×50mm，1.7μm流动相：乙腈-磷酸水溶液，洗脱程序为：发明人在对红牛膝的化学成分进行分离纯化过程中，发现了多种齐墩果酸类皂苷成分，其中就包括3-O-[α-L-吡喃鼠李糖1→3-β-D-吡喃葡萄糖醛酸]-齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖。经药理研究及临床验证表明，皂苷类成分具有保肝护肝、调节免疫、抗炎、抑菌、抗病毒、延缓衰老、防治心血管疾病等作用[1-4]，在药品及保健品的开发中具有广阔的应用前景。另外，经过UPLC检测发现，发明人鉴定的几种皂苷类成分中，3-O-[α-L-吡喃鼠李糖1→3-β-D-吡喃葡萄糖醛酸]-齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖在各批次药材中的含量波动较小。以此成分来作为检测红牛膝的指标成分，不仅可以从一定程度上反应药效，还可以使得检测结果更加稳定，重现性好。本发明首次使用3-O-[α-L-吡喃鼠李糖1→3-β-D-吡喃葡萄糖醛酸]-齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖作为检测红牛膝的指标成分，本发明采用UPLC对红牛膝中的该成分进行检测，具有良好的稳定性、重现性，并且本发明检测方法能够有效将该成分与其他成分分离，不仅能够达到对该成分的定性，还可以同时满足定量检测的需求。进一步地，步骤1中，所述醇类溶剂选自甲醇或乙醇。进一步地，所述含水醇类溶剂中醇类溶剂的浓度为60～85％vv。更进一步地，步骤1中，所述含水醇类溶剂中醇类溶剂的浓度为70～80％vv，例如70％、75％、80％等。当然，在醇类溶剂的配置过程中难免会有一定的浓度误差，本发明中的浓度同样应该包含可允许的浓度范围，例如80±2％vv。相较于甲醇而言，乙醇在安全性和环境方面更优越，因此，本发明一个具体实施方式中，所述醇类溶剂选自乙醇。其中，所述适当溶剂，是可以溶解目标成分，同时不干扰检测结果的溶剂。本发明中，所述适当溶剂可以选自甲醇、含水甲醇、乙腈或含水乙腈。本发明中磷酸水溶液的浓度可以通过适当的试验加以筛选，找到适合本发明检测方法的磷酸水溶液浓度，如果酸性太大，可以选择耐酸的色谱柱。本发明色谱柱填料为C18，当然也允许使用在C18基础上做出的改性的填料色谱柱，色谱柱应满足超高效液相的基本要求，并不需要限定本发明记载的产品型号，本发明一个具体实施方式中使用的具体色谱柱为ACQUITYUPLCHSSC18。本发明一个具体实施方式中，所述磷酸水溶液中，磷酸的浓度为0.05～0.15％vv，可以是0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.10％、0.11％、0.12％、0.13％、0.14％、0.15％等。现有的高效液相或超高效液相色谱仪，大部分都可以实现全波段扫描，即便不载明检测波长，本领域技术人员也可以通过全波段扫描找到适合检测的波长范围。当然，对于没有全波段扫描功能的色谱仪来讲，亦可以通过紫外分光光度仪来做获得较为适合的检测波长范围。本发明一个具体实施方式中，使用检测波长检测波长为210nm，当然，在210nm附近对波长进行小幅度的修改，亦可适合检测。其中，UPLC检测过程中，流速一般比HPLC要低，常用的流速为0.1～0.4mLmin，本发明一个具体实施方式中，选用的流速为0.2mLmin。其中，柱温通常选择在25～45℃，本发明一个具体实施方式中，选用柱温为40℃。本发明还提供了红牛膝的质量检测方法，按照上述方法进行检测，检测结果满足如下条件，证明红牛膝质量合格；经上述方法检测，按干燥品计算，红牛膝中含3-O-[α-L-吡喃鼠李糖1→3-β-D-吡喃葡萄糖醛酸]-齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖不少于1.0％ww。本发明还提供了另一种红牛膝的质量检测方法，它包括如下步骤：A、薄层检测：取红牛膝，以含水或不含水的醇类溶剂提取，提取液浓缩至无醇味，以石油醚-水两相溶剂进行脱脂，剩余水相再用正丁醇萃取，取正丁醇相，除去正丁醇后，使用适当溶剂制备供试品溶液；取3-O-[α-L-吡喃鼠李糖1→3-β-D-吡喃葡萄糖醛酸]-齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖，使用适当溶剂制备对照品溶液；吸取供试品溶液、对照品溶液各，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯：甲酸：水＝10:1:1vvv为展开剂，展开，取出，晾干，喷以硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，置日光或和紫外光灯下检视；B、UPLC检测：取红牛膝，以含水或不含水的醇类溶剂提取，提取液浓缩至无醇味，以石油醚-水两相溶剂进行脱脂，剩余水相再用正丁醇萃取，取正丁醇相，除去正丁醇后，使用适当溶剂制备供试品溶液；取3-O-[α-L-吡喃鼠李糖1→3-β-D-吡喃葡萄糖醛酸]-齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖，使用适当溶剂制备对照品溶液；将供试品溶液和对照品溶液经超高效液相色谱法检测；其中，如果经步骤A检测的供试品色谱中，在与对照品相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，则再进行步骤B进行验证，经方法B检测，按干燥品计算，红牛膝中含3-O-[α-L-吡喃鼠李糖1→3-β-D-吡喃葡萄糖醛酸]-齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖不少于1.0％ww，则表明红牛膝质量合格；如果经步骤A检测的供试品色谱中，在与对照品相应的位置上，未显相同颜色的荧光斑点，则不再进行步骤B的检测，所检测的药材质量不合格。其中，所述硫酸乙醇溶液的浓度为10％vv；在105℃加热至斑点显色清晰；紫外光灯的波长为365nm。将薄层色谱与UPLC联合使用，可以利用薄层的方便灵活性对药材进行快速的初步检测，若满足薄层色谱的检测结果要求，可再经UPLC进行检测，以便更为精确的检测药材的品质。当然，若不能满足薄层色谱的检测结果要求，则无需再进行UPLC的检测，则可直接认定为不合格品，甚至可能是伪品。本发明中所述的“提取”，是指采用天然药物领域内常用的提取手段，例如煎煮、回流、超声、微波辅助提取、浸渍、渗渌等方法中的一种或多种的组合。本发明中所述的“浓缩至无醇味”，是指采用天然药物领域中常用的浓缩方法，使溶剂中的醇挥发完全或接近完全，浓缩后，剩余物在进一步的操作中不会受到醇类溶剂的影响或者影响不大。常用的浓缩手段有减压浓缩、低温加热挥发、薄膜浓缩等。本发明所述“石油醚-水两相溶剂”，是指在操作过程中同时存在石油醚和水这两种溶剂，石油醚是脱脂的常用溶剂，石油醚和水组成的溶剂组合是脱脂的常用溶剂组合形式。具体操作过程中，如果待脱脂物含有足够的水，则可直接加入石油醚进行脱脂处理，加水并非是必须步骤；如果待脱脂物不含水或含水量太少，则需要加入石油醚和适量水进行脱脂处理。采用正丁醇萃取时，由于水和正丁醇在一定比例内互溶，为避免萃取时目标成分的过量损失，本领域一般情况下都使用水饱和正丁醇。附图说明图1化合物Ⅲ1HNMR图MeOD-d4图2化合物Ⅲ13CNMR图MeOD-d4图3化合物Ⅳ1HNMR图MeOD-d4图4化合物Ⅳ13CNMR图MeOD-d4图5化合物Ⅴ1HNMR图MeOD-d4图6化合物Ⅴ13CNMR图MeOD-d4图7空白对照A、混合对照品B和样品CUPLC图，1：HNX-5，2：HNX-3图8薄层色谱展开剂条件优化，1：西昌彝医药研究所201606，2：西昌彝医药研究所201512，3：凉山州会理县六华乡大坪村201310，4：对照品5：凉山州会理县六华乡光明村201310，6：西昌彝医药研究所201209；其中，图8中的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ分别对应不同的展开剂具体实施方式实施例1为了进一步明确彝药红牛膝中的化学成分、有效成分、获得对照品，建立红牛膝药材及其成方制剂的质量标准，阐明红牛膝药理药效的物质基础，本实施例对红牛膝药材的化学成分进行了比较系统的研究。1仪器与材料1.1仪器WatersAcquityUPLCH-ClassSystem型超高效液相色谱仪美国Waters公司；METTLERAE240电子分析天平梅特勒-托利多上海仪器有限公司；KQ-250B型超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司；IKARV10旋转蒸发器德国IKA公司；SHB-Ⅲ循环水式真空泵巩义市英峪华科仪器厂；数显恒温水浴锅HH-2国华电器有限公司。1.2材料与试剂红牛膝，红牛膝药材采自四川省凉山彝族自治州会理县六华乡大坪村，经西南民族大学刘圆教授鉴定为苋科植物头花杯苋CyathulacapitataWall.Moq.的根。硅胶G板中国青岛海洋化工集团公司；柱层析硅胶100-200目；200-300目；青岛海洋化工厂；葡聚糖凝胶LH-20填料日本三菱化工有限公司；三氯甲烷、甲醇、甲酸、正丁醇、乙酸乙酯、乙醇、硫酸等为分析纯；水为蒸馏水。2试验方法2.1药材的提取、分离取红牛膝药材过2号筛1000g，按液料比20:1加入体积分数为80％乙醇，90℃条件下提取3次，每次60min，趁热过滤，合并滤液，滤液减压浓缩至无醇味后，加蒸馏水约500mL使溶解，水相分别用石油醚60-90℃，500mL×3、三氯甲烷500mL×3乙酸乙酯500mL×5和正丁醇萃取500mL×5，减压回收溶剂后得乙酸乙酯部分4.2g，正丁醇部分35.0g。乙酸乙酯部分4.2g用少量甲醇溶解，加硅胶5g，100-200目拌匀，干法装柱，抽实。乙酸乙酯:石油醚0-100％为洗脱剂梯度洗脱，TLC检测，合并相同组分，减压浓缩得化合物Ⅰ50mg。正丁醇部分10g用少量甲醇溶解，加硅胶20g，100-200目拌匀，干法装柱，抽实。依次用三氯甲烷:甲醇:水15:1:0.2，1L；10:1:0.2，1L；8:1:0.2，2L；6:1:0.2，2L；3:1:0.2，4L；2:1:0.2，5L下相梯度洗脱，每25mL一份，TLC检测，5﹪浓硫酸乙醇为显色剂，合并相同组分，并对合并的相同组份进行编号可以从“1”开始，分别减压浓缩得组分1、2、3、4、5。取组分2经反复硅胶柱层析三氯甲烷:甲醇:水＝10:1:0.1得化合物Ⅱ42mg。取组分3用少量甲醇溶解，加适量硅胶200-300目拌匀上硅胶柱，用三氯甲烷:甲醇:水6:1:0.2，200mL；3:1:0.2，600mL；2:1:0.2，1.2L下相梯度洗脱，TLC检测，合并相同组分，减压浓缩，上葡聚糖凝胶柱，甲醇-水50:50洗脱，得化合物Ⅲ89mg，组分4上硅胶柱，用三氯甲烷:甲醇:水6:1:0.2，200mL；3:1:0.2，800mL；2:1:0.2，1.5L下相梯度洗脱，TLC检测，合并相同组分，减压浓缩，上葡聚糖凝胶柱，甲醇-水50:50洗脱，得化合物Ⅳ38mg，组分5上硅胶柱，用三氯甲烷:甲醇:水4:1:0.2，400mL；3:1:0.2，1.5L；2:1:0.2，2L下相梯度洗脱，TLC检测，合并相同组分，减压浓缩，上葡聚糖凝胶柱，甲醇-水30:70洗脱，得化合物Ⅴ105mg。2.2结构鉴定化合物Ⅰ：白色片状结晶，与β-谷甾醇对照品分别点于同一薄层板，在三种不同溶剂系统中Rf值和显色均一致，混合后熔点不降低，确定化合物Ⅰ为β-谷甾醇，附图2。化合物Ⅲ：白色粉末状结晶，水溶液振摇后产生持久性泡沫，Libermann-Burchard反应呈阳性，经酸水解，薄层色谱鉴别，苷元为齐墩果酸。ESI-MSmz777.3056[M-H]-，给出分子式C42H66O13，表明分子中苷元连有2个糖基，碎片离子：631.2922[M-H-146]-，455.2480[M-H-146-176]-，推测分子中连有鼠李糖和葡萄糖醛酸，13C-NMR谱中δ123.69，145.20为烯碳特征信号，δ181.90为羧基碳信号，HNMRMeOD-d4谱中δ1.151H，s、1.041H，s、0.941H，s、0.931H，s、0.901H，s、0.831H，s、0.801H，s，δ5.231H，t，为齐墩果酸结构片段，13C-NMR显示两个糖端基信号，谱中δ102.63和106.67ppm信号，确定了糖的构型，鼠李糖为α-L-型，葡萄糖醛酸为β-D-型，91.04ppm信号表明苷元3位与葡萄糖醛酸连接，83.67ppm信号表明鼠李糖连接在葡萄糖醛酸的3位上。将化合物Ⅲ的光谱数据与文献[5]比较，基本一致，鉴定化合物3为3-O-[α-L-吡喃鼠李糖1→3-β-D-吡喃葡萄糖醛酸]-齐墩果酸。化合物Ⅳ：白色粉末状结晶，水溶液振摇后产生持久性泡沫，Libermann-Burchard反应呈阳性，经酸水解，薄层色谱鉴别，苷元为齐墩果酸。ESI-MSmz793.36[M-H]-，给出分子式C42H66O14，表明分子中苷元连有2个糖基，与化合物Ⅲ相比，分子中多一个氧原子，推测分子中连有葡萄糖和葡萄糖醛酸，13C-NMR谱中δ123.86，144.85为烯碳特征信号，δ178.07为羧基碳信号，HNMRMeOD-d4谱中δ1.171H，s、1.071H，s、0.971H，s、0.951H，s、0.931H，s、0.861H，s、0.811H，s，δ5.271H，t，为齐墩果酸结构片段，13C-NMR显示两个糖端基信号，谱中δ95.72、和106.98ppm信号，确定了糖的构型，葡萄糖与葡萄糖醛酸均为β-D型，δ95.72ppm信号表明苷元28位与葡萄糖连接，91.09ppm信号表明苷元3位与葡萄糖醛酸连接。将化合物5的光谱数据与文献[6]比较，基本一致，鉴定化合物Ⅳ为3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸-齐墩果酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。化合物Ⅴ：白色粉末状结晶，水溶液振摇后产生持久性泡沫，Libermann-Burchard反应呈阳性，经酸水解，薄层色谱鉴别，苷元为齐墩果酸。ESI-MSmz939.2986[M-H]-，给出分子式C48H76O18，表明分子中苷元连有3个糖基，碎片离子：777.3056[M-H-162]-，455.2480[M-H-162-146-176]-，推测分子中连有葡萄糖、鼠李糖和葡萄糖醛酸，13C-NMR谱中δ123.69，145.20为烯碳特征信号，δ181.90为羧基碳信号，HNMRMeOD-d4谱中δ1.151H，s、1.041H，s、0.941H，s、0.931H，s、0.901H，s、0.831H，s、0.801H，s，δ5.231H，t，为齐墩果酸结构片段，13C-NMR显示三个糖端基信号，谱中δ95.74、102.63和106.67ppm信号，确定了糖的构型，鼠李糖为α-L-型，葡萄糖与葡萄糖醛酸为β-D-型，δ95.74ppm信号表明苷元28位与葡萄糖连接，90.90ppm信号表明苷元3位与葡萄糖醛酸连接，83.54ppm信号表明鼠李糖连接在葡萄糖醛酸的3位上。将化合物Ⅴ的光谱数据与文献[6]比较，基本一致，鉴定化合物5为3-O-[α-L-吡喃鼠李糖1→3-β-D-吡喃葡萄糖醛酸]-齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。化合物Ⅲ：R1＝H，化合物Ⅳ：化合物Ⅴ：化合物Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ的化学结构表1皂苷元的碳核磁共振化学位移值MeOD-d4表2皂苷中糖部分的碳核磁共振化学位移值MeOD-d4表3皂苷中皂苷元和糖的部分氢核磁共振化学位移值MeOD-d43小结对红牛膝中的化学成分进行研究，分离得到5个化合物，鉴定其中4个，分别为β-谷甾醇Ⅰ，3-O-[α-L-吡喃鼠李糖1→3-β-D-吡喃葡萄糖醛酸]-齐墩果酸Ⅲ，3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸-齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖Ⅳ和3-O-[α-L-吡喃鼠李糖1→3-β-D-吡喃葡萄糖醛酸]-齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖Ⅴ，以上4个化合物均为首次在该植物中分离得到。试验过程中发现：红牛膝中含有大量皂苷类成分，皂苷类成分极性较大，分离困难，乙酸乙酯-甲酸-水洗脱体系可取得较好分离效果，但浓缩过程中会出现较多杂质点，可能因酸性较强致化合物分解，最终选择三氯甲烷:甲醇:水体系进行洗脱。实施例2仪器与材料1.1仪器WatersAcquityUPLCH-CLassSystem型超高效液相色谱仪美国Waters公司；METTLERAE240电子分析天平梅特勒-托利多上海仪器有限公司；IKARV10旋转蒸发器德国IKA公司；KQ-250B型超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司；SHB-Ⅲ循环水式真空泵巩义市英峪华科仪器厂；数显恒温水浴锅HH-2国华电器有限公司。1.2材料与试剂药材来源见表4，经西南民族大学刘圆教授鉴定为苋科植物头花杯苋CyatHulaCapitataWall.Moq.的干燥根，凭证标本保存于西南民族大学民族医药研究院标本室；对照品3-O-[α-L-吡喃鼠李糖1→3-β-D-吡喃葡萄糖醛酸]-齐墩果酸简称HNX-3和3-O-[α-L-吡喃鼠李糖1→3-β-D-吡喃葡萄糖醛酸]-齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖简称HNX-5，为实验室自制，经核磁和质谱鉴定，采用面积归一化法计算，纯度96％和95％；乙腈色谱纯，美国SIGMA公司，磷酸色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司，石油醚、乙醇、正丁醇等为国产分析纯，市售；蒸馏水，实验室自制。表4红牛膝药材来源2试验方法2.1色谱条件和系统适应性试验2.1.1流动相的选择色谱柱：ACQUITYUPLCHSSC182.1×50mm，1.7μm；流动相组成：乙腈-0.1％磷酸水，线性梯度洗脱，洗脱程序见表5；流速：0.2mL.min-1；检测波长：210nm；进样量：1μL；柱温：40℃。表5梯度洗脱程序2.1.2适应性选择分别精密吸取混合对照品、供试品溶液进样。在上述色谱条件下，混合对照品溶液和样品溶液各成分均可与相邻组分分离，满足含量测定要求，UPLC色谱图见图7。2.2对照品溶液的制备分别取HNX-3和HNX-5适量，精密称定，用甲醇作溶剂配制成浓度分别为1.005、1.010mg.mL-1的对照品母液，备用。2.3标准曲线的绘制分别精密吸取皂苷的对照品母液，用甲醇稀释、定容，得系列质量浓度的对照品溶液，取上述溶液1μL注入超高效液相色谱仪，记录峰面积。以峰面积Y对进样量x，μg进行线性回归，得回归方程：HNX-3：Y1＝1E+06x+9739.6R2＝0.9997，HNX-5：Y2＝984877x-1995.7R2＝0.9999，质量浓度依次在0.1005～1.206mgmL、0.101～1.212mgmL范围内与峰面积线性关系良好。2.4供试品溶液的制备精密称取红牛膝根粉末过2号筛1.0g，加入80％乙醇vv20mL，加热回流1h，滤过，滤液浓缩至无醇味，加水30mL，石油醚30mL脱脂后正丁醇萃取30mL×2，减压浓缩除去正丁醇，残渣加甲醇定容于25mL容量瓶内，即得供试品溶液，备用。3结果与分析3.1精密度试验取混合对照品溶液，按照“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积并计算RSD值得：HNX-3为0.39％、HNX-5为0.93％，表明仪器精密度良好。3.2重复性试验称取红牛膝根粉末6份，按供试品的制备方法和选定的色谱条件测定样品，计算皂苷成分的含量。结果其含量分别为HNX-3和HNX-5平均值分别为9.70、21.68mg.g-1，RSD值依次为2.18％、1.94％，表明方法重复性良好。3.3稳定性试验取同一红牛膝样品溶液，室温放置，分别于0、2、4、6、8、12h按选定色谱条件进行测定，计算皂苷类成分含量，其RSD值分别为化合物1.27％、1.68％，表明样品在12h内稳定。3.4加样回收率试验称取已知含量红牛膝根粉末6份，每份0.25g，分别精密加入质量分数为已知含量样品中HNX-3和HNX-5含量的80％、100％、120％对照品，按供试品溶液制备方法制备，按选定色谱条件测定，计算回收率，结果见表6。表6加样回收率试验3.5不同批次红牛膝药材含量测定分别称取不同批次红牛膝根样品粉末各1.0g，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，“2.1”项下色谱条件测定，记录峰面积，根据回归方程计算含量。测定结果见表7。表7红牛膝样品中两种皂苷含量mg·g-14小结1试验中考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1磷酸水等流动相体系对红牛膝皂苷类成分的洗脱效果，结果乙腈-0.1磷酸水洗脱效果最好，各成分均可达到基线分离，皂苷类成分紫外吸收较弱，波长选在210nm处，各成分均有较强吸收，且杂质干扰较小，最终选择210nm为本次试验检测波长，本试验建立的检测方法简单、快速、重复性好，可以用于红牛膝药材中皂苷类成分的检测。2皂苷类成分具有抗炎、镇痛、抗氧化等药理活性，是彝药材红牛膝中主要药效成分之一，本试验首次采用UPLC法对彝药红牛膝中皂苷类成分进行含量测定，目前对于红牛膝药材化学成分研究较少，暂无可用对照品。自制的HNX-3和HNX-5含量均在95％以上，可用于含量测定。3测定6批样品中，HNX-3含量差异较大，最低为2.09mg·g-1，最高为9.45mg·g-1，平均含量为5.02mg·g-1；两种皂苷总和前5批样品差异不大。S1-S5样品中HNX-5的含量较为接近，该成分在药材中含量均衡，因此，HNX-5能很好的反应红牛膝药材中总皂苷的含量，将HNX-5作为红牛膝药材皂苷类成分的质量控制指标，除样品S6外，HNX-5含量均较高，最低为17.55mg·g-1S5，最高达到26.25mgS2，平均含量为20.34mg·g-1，鉴于本次试验样品批次较少，红牛膝药材中HNX-5含量暂定不低于10mg·g-11.0％为合格。实施例3薄层色谱鉴别1对照品溶液的配制取对照品HNX-5适量，加甲醇制成每1mL含2mg的溶液，作为对照品溶液。2供试品溶液的配制取本品粉末1g，按文中4.3项下优化所得方法提取样品，即加入80％乙醇vv20mL，加热回流1h，滤过，滤液浓缩至无醇味，加水30mL，石油醚30mL脱脂后正丁醇萃取30mL×2，减压浓缩除去正丁醇，残渣加甲醇2mL使溶解。作为供试品溶液。3薄层色谱条件考察3.1展开方式取对照品和样品各5μL点于同一硅胶G板200mm×100mm，上行展开，展开至约18cm。3.2显色喷以10％硫酸乙醇溶液，于105℃烘至显色清晰，分别在日光及紫外灯365nm处检视。3.3展开剂的选择：Ⅰ：三氯甲烷-甲醇-水65:35:10Ⅱ：乙酸乙酯-水-甲酸15:1:1Ⅲ：三氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯-水2:1:0.6:0.2Ⅳ：三氯甲烷-甲醇-水-甲酸7:3:0.5:0.05Ⅴ：乙酸乙酯-水-甲酸10:1:13.4结果与分析展开剂筛选结果见图8。由图可知：所选择的5种展开体系中，供试品在与对照品相同位置，均可显示相同颜色斑点，但条件Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ供试品色谱分离较差，上下斑点未能完全分离，Ⅱ、Ⅴ分离效果较好，与Ⅴ相比，条件Ⅱ各点均得到较好分离，斑点圆润，分离效果最佳，最终选择条件Ⅱ为薄层色谱展开条件。实施例4红牛膝质量检测红牛膝，本品为苋科植物头花杯苋CyathulacapitataWall.Moq.的干燥根。秋冬二季采挖，除去芦头、须根和泥沙，晒干或低温烘干。采用下述方法进行红牛膝的质量检测时，可线采用薄层检测，如具有对照品相应斑点，则可以继续进行UPLC检测，若未见对照品相应斑点，则可以无需再进入下一个环节的检测。1薄层检测：取本品粉末1g，加80％乙醇20mL，加热回流1h，滤过，滤液浓缩至无醇味，加水30mL，石油醚30mL脱脂后正丁醇萃取30mL×2，减压浓缩除去正丁醇，残渣加甲醇2mL使溶解。作为供试品溶液。再取3-O-[α-L-吡喃鼠李糖1→3-β-D-吡喃葡萄糖醛酸]-齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法附录ⅥB试验，吸取供试品溶液、对照品溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-水10:1:1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置日光及紫外光灯365nm下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。2UPLC检测：色谱条件与系统适用性试验色谱柱：ACQUITYUPLCHSSC182.1×50mm，1.7μm；流动相组成：乙腈-0.1％磷酸水，线性梯度洗脱，洗脱程序见下表；流速：0.2mL.min-1；检测波长：210nm；进样量：1μL；柱温：40℃。对照品溶液的制备取3-O-[α-L-吡喃鼠李糖1→3-β-D-吡喃葡萄糖醛酸]-齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含1.010mg的溶液，即得。供试品溶液的制备精密称取红牛膝根粉末过2号筛1.0g，加入80％乙醇vv20mL，加热回流1h，滤过，滤液浓缩至无醇味，加水30mL，石油醚30mL脱脂后正丁醇萃取30mL×2，减压浓缩除去正丁醇，残渣加甲醇定容于25mL容量瓶内，即得。测定法分别精密吸取对照品溶液1μL与供试品溶液1μL，注入超高效液相色谱仪，测定，即得。本品按干燥品计算，含3-O-[α-L-吡喃鼠李糖1→3-β-D-吡喃葡萄糖醛酸]-齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖不得少于1.0％。引用文献信息：[1]李金亭，胡正海.牛膝类药材的生物学与化学成分的研究进展[J].中草药，2006，376：952-956.[2]孟大利，李铣.中药牛膝化学成分和药理活性的研究进展[J].中国药物化学杂志，2001，112：120-124.[3]廖彭莹，王东，杨崇仁，张颖君.苋科牛膝资源植物的化学成分研究进展[J].中草药，2013，4414:2019-2026.[4]王菊平，吴晓东，宋献美.牛膝总皂苷对过氧化氢致人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用研究[J].亚太传统医药，2016，122：10-12.[5]周容.川牛膝及西南风车子的化学成分研究[D].中国科学院成都有机化学研究所，2004.[6]王晓娟，朱玲珍.牛膝皂甙的化学成分研究[J].第四军医大学学报，1996，176：32-35.

权利要求：1.红牛膝的检测方法，其特征在于：它包括如下操作：1取红牛膝，以含水或不含水的醇类溶剂提取，提取液浓缩至无醇味，以石油醚-水两相溶剂进行脱脂，剩余水相再用正丁醇萃取，取正丁醇相，除去正丁醇后，使用适当溶剂制备供试品溶液；2取3-O-[α-L-吡喃鼠李糖1→3-β-D-吡喃葡萄糖醛酸]-齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖，使用适当溶剂制备对照品溶液；3将供试品溶液和对照品溶液经超高效液相色谱法检测，即可实现定性或定量检测；其中，色谱条件如下:色谱柱：填料为C18，尺寸为2.1×50mm，1.7μm流动相：乙腈-磷酸水溶液，洗脱程序为：2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤1中，所述醇类溶剂选自甲醇或乙醇；所述含水醇类溶剂中醇类溶剂的浓度为60～85％vv。3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：步骤1中，所述含水醇类溶剂中醇类溶剂的浓度为70～80％vv。4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述适当溶剂选自甲醇、含水甲醇、乙腈或含水乙腈。5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤3中，所述磷酸水溶液中，磷酸的浓度为0.05～0.15％vv。6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：检测波长为约210nm。7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：色谱条件中，流动相流速为0.2mL.min-1，柱温为40℃。8.红牛膝的质量检测方法，其特征在于：按照权利要求1～7任意一项所述方法进行检测，检测结果满足如下条件，证明红牛膝质量合格；经检测，按干燥品计算，红牛膝中含3-O-[α-L-吡喃鼠李糖1→3-β-D-吡喃葡萄糖醛酸]-齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖不少于1.0％ww。9.红牛膝的质量检测方法，其特征在于：它包括如下步骤：A、薄层检测：取红牛膝，以含水或不含水的醇类溶剂提取，提取液浓缩至无醇味，以石油醚-水两相溶剂进行脱脂，剩余水相再用正丁醇萃取，取正丁醇相，除去正丁醇后，使用适当溶剂制备供试品溶液；取3-O-[α-L-吡喃鼠李糖1→3-β-D-吡喃葡萄糖醛酸]-齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖，使用适当溶剂制备对照品溶液；吸取供试品溶液、对照品溶液各，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯：甲酸：水＝10:1:1vvv为展开剂，展开，取出，晾干，喷以硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，置日光或和紫外光灯下检视；B、UPLC检测：取红牛膝，以含水或不含水的醇类溶剂提取，提取液浓缩至无醇味，以石油醚-水两相溶剂进行脱脂，剩余水相再用正丁醇萃取，取正丁醇相，除去正丁醇后，使用适当溶剂制备供试品溶液；取3-O-[α-L-吡喃鼠李糖1→3-β-D-吡喃葡萄糖醛酸]-齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖，使用适当溶剂制备对照品溶液；将供试品溶液和对照品溶液经超高效液相色谱法检测；其中，如果经步骤A检测的供试品色谱中，在与对照品相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，则再进行步骤B进行验证，经方法B检测，按干燥品计算，红牛膝中含3-O-[α-L-吡喃鼠李糖1→3-β-D-吡喃葡萄糖醛酸]-齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖不少于1.0％ww，则表明红牛膝质量合格；如果经步骤A检测的供试品色谱中，在与对照品相应的位置上，未显相同颜色的荧光斑点，则不再进行步骤B的检测，所检测的药材质量不合格；其中，超高效液相色谱法的色谱条件如下:色谱柱：填料为C18，尺寸为2.1×50mm，1.7μm流动相：乙腈-磷酸水溶液，洗脱程序为：10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述硫酸乙醇溶液的浓度为10％vv；在105℃加热至斑点显色清晰；紫外光灯的波长为365nm。

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