申请/专利权人：南京诺云生物科技有限公司

申请日：2016-03-31

公开（公告）日：2021-01-05

公开（公告）号：CN107286227B

主分类号：C07K14/36(20060101)

分类号：C07K14/36(20060101);C12P17/12(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.01.05#授权;2017.11.24#实质审查的生效;2017.10.24#公开

摘要：本发明涉及StreptomyceshirsutusATCC19091蛋白的新用途，属于生物技术领域。具体来说，是指StreptomyceshirsutusATCC19091蛋白作为催化剂的用途。通过其催化L‑2‑哌啶甲酸的合成体系，具有底物投量高，反应时间短，产物ee值高的特点。

主权项：1.StreptomyceshirsutusATCC19091蛋白作为催化剂的用途，所述的StreptomyceshirsutusATCC19091蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示，所述的催化剂用以催化L-赖氨酸盐酸盐或L-赖氨酸生物转化制备L-2-哌啶甲酸的反应。

全文数据：StreptomyceshirsutusATGG19091蛋白的新用途技术领域[0001]本发明涉及StreptomyceshirsutusATCC19091蛋白的新用途，属于生物技术领域。背景技术[0002]StreptomyceshirsutusATCC19091蛋白是来源于Streptomyceshirsutus的一种蛋白，其氨基酸序列为序列表中序列2。用于其编码的基因序列为序列表中序列1。发明内容[0003]本发明的目的是提供了StreptomyceshirsutusATCC19091蛋白的一种新用途，具体来说，是指其作为催化剂的用途。[0004]更进一步地，是用以催化L-赖氨酸盐酸盐或L-赖氨酸生物转化制备L-2-哌啶甲酸的反应。[0005]为了实现StreptomyceshirsutusATCC19091蛋白的催化作用，我们需要获得一种可以高效表达这一蛋白的菌体，从而以全细胞催化剂的形式将其加入到反应体系中。[0006]在本发明中，我们选定的用于高效表达StreptomyceshirsutusATCC19091蛋白的菌体为大肠杆菌。然而，在StreptomyceshirsutusATCC19091中用以编码StreptomyceshirsutusATCC19091蛋白的野生型基因序列GC含量过高，在宿主菌中培养时难以实现高效转录。故通过全基因合成的方法，对基因的二级结构以及密码子偏好性进行调整，并且调整DNA序列的GC含量到40%〜60%，以实现在大肠杆菌中的高表达。[0007]首先，我们利用PrimerPremierhttp:primer3·ut·ee和OPTIMIZERhttp:genomes.urv.esOPTIMIZER进行设计，并保证Tm差异控制在3°C以内，引物长度控制在50base以内，得到以下引物：合成上述引物，并将获得的引物加双蒸水溶解后，加到如下的反应体系中，使得各引物的终浓度为30nM，首尾引物的终浓度为0.6μΜ。[0008]将配制好的PCR反应体系置于博日XPcycler基因扩增仪中，按下列程序进行扩增:98°C30s，65°C45s，72°C120s，35x。将PCR得到的DNA片段进行切胶纯化，利用同源重组的方法克隆进pET30a的NdelXhol位点。挑取单克隆进行测序。测序成功的DNA序列为SEQIDΝ0·3〇[0009]按照图I的方式构建含有SEQIDNO.3的表达质粒。[0010]挑取含有SEQIDNO.3的表达质粒的大肠杆菌单菌落接种于IOml高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨I〇gL，酵母提取物5gL，磷酸氢二钠3.55gL，磷酸二氢钾3.4gL，氯化铵2.68gL，硫酸钠0.7lgL，七水硫酸镁0.493gL，六水氯化铁0.027gL，甘油5gL，葡萄糖0.8gL，添加卡那霉素至5〇1^匕30°：，250印111过夜培养。次日取IL三角瓶，按1:100的接种比例接入到IOOml高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨10gL，酵母提取物5gL，磷酸氢二钠3·55gL，磷酸二氢钾3·4gL，氯化铵2·68gL，硫酸钠0·71gL，七水硫酸镁0·493gL，六水氯化铁〇.〇27gL，甘油5gL，葡萄糖0.3gL，添加卡那霉素至50mgL。于30°C中培养至菌体OD5-6,立刻将三角瓶置于25°C摇床中，250rpm培养1小时。加IPTG至终浓度O.lmM，并于25°C，250rpm继续培养16小时。培养结束后，将培养液于4°C，12000g下离心20分钟收集湿菌体。然后将菌体沉淀用蒸馏水清洗两次，收集菌体，_70°C保存。[0011]将所收集得到的大肠杆菌作为全细胞催化剂加入至L-赖氨酸盐酸盐生物转化制备L-2-哌啶甲酸的反应中，从而获得了一种高效率的生物催化系统。这一系统具有底物投量高，反应时间短，产物ee值高的特点。附图说明[0012]图1为SEQIDNO.3的表达质粒图谱图2为含有SEQIDNO.3表达质粒的大肠杆菌的SDS-PAGE图谱。[0013]图3为生物转化反应的TLC图谱图4为L-2-哌啶甲酸的HPLC谱图图5为L-2-哌啶甲酸的MS谱图具体实施方式[0014]为了更好的解释本发明，下面结合实施例对本发明进行进一步的阐述。在本实施例中所用到的仪器、试剂，除非有特殊说明，均为市售产品。[0015]以下实施例中涉及到的TLC检测中：展开剂:三氯甲烷：甲醇:水=6:5:1，混匀后放置IOmin左右。[00Ί6]娃胶板规格:薄层层析娃胶板5*10。[0017]显色剂:讳三酮显色IOOml乙醇加入〇.Ig讳三酮，500ul冰乙酸混匀。[0018]以下实例中涉及到的LC-MS检测条件为：卩代¥3：[1]18色谱柱（250\4.6111111，;[.1.5以111;柱温：30°0;流动相:0.4%八三氟乙酸水溶液;流速:0.5mlmin;检测器:蒸发光散射检测器ELSD;检测器温度：120°C;载气:氮气纯度99.9%;载气流速:4Lmin;进样体积：10yL。[0019]实施例1将StreptomyceshirsutusATCC19091置于ATCCMedium196培养基中培养，控制温度为26.0°C，180rpm培养2天，离心收集沉淀，用DNA提取纯化试剂盒QiAampKitQiagen，Germany提取纯化StreptomyceshirsutusATCC19091基因组DNA。[0020]用Pfu高保真酶对StreptomyceshirsutusATCC19091基因组DNA进行PCR扩增，所用引物为由于StreptomyceshirsutusATCC19091的DNA局部GC含量接近80%，故在扩增时添加终浓度0.5M的甜菜碱。之后将扩增的片段用Taq聚合酶72°C处理10分钟，在DNA3’端添加碱基A。之后将其连接到pMD19T-simpleTakara宝生物公司，北京克隆载体中，挑取单克隆送至上海杰李生物进行测序。测序得到DNA序列为SEQIDNO.1，相应的氨基酸序列为SEQIDNO.2实施例2通过全基因合成的方法，对基因的二级结构以及密码子偏好性进行调整，并且调整DNA序列的GC含量到40%〜60%，以实现在大肠杆菌中的高表达。利用PrimerPremierhttp:primer3·ut·ee和OPTIMIZERhttp:genomes·urv·esOPTIMIZER进行设计，并保证Tm差异控制在3°C以内，引物长度控制在50base以内，得到以下引物：合成上述引物，并将获得的引物加双蒸水溶解后，加到如下的反应体系中，使得各引物的终浓度为30nM，首尾引物的终浓度为0.6μΜ。[0021]~将配制好的PCR反应体系置于博日XPcycler基因扩增仪中，按下列程序进行扩增:98°C30s，65°C45s，72°C120s，35x。将PCR得到的DNA片段进行切胶纯化，利用同源重组的方法克隆进pET30a的NdeIXhoI位点。挑取单克隆进行测序。测序成功的DNA序列为SEQIDΝ0·3〇[0022]实施例3挑取含有SEQIDNO.3表达载体的大肠杆菌单菌落接种于IOml高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨l〇gL，酵母提取物5gL，磷酸氢二钠3.55gL，磷酸二氢钾3.4gL，氯化铵2.68gL，硫酸钠0.7lgL，七水硫酸镁0.493gL，六水氯化铁0.027gL，甘油5gL，葡萄糖0.8gL，添加卡那霉素至5〇1^匕30°：，250印111过夜培养。次日取IL三角瓶，按1:100的接种比例接入到IOOml高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨10gL，酵母提取物5gL，磷酸氢二钠3·55gL，磷酸二氢钾3·4gL，氯化铵2·68gL，硫酸钠0·71gL，七水硫酸镁0·493gL，六水氯化铁〇.〇27gL，甘油5gL，葡萄糖0.3gL，添加卡那霉素至50mgL。于30°C中培养至菌体OD5-6,立刻将三角瓶置于25°C摇床中，250rpm培养1小时。加IPTG至终浓度O.lmM，并于25°C，250rpm继续培养16小时。培养结束后，将培养液于4°C，12000g下离心20分钟收集湿菌体。然后将菌体沉淀用蒸馏水清洗两次，收集菌体，-70°C保存。同时取少量菌体进行SDS-PAGE检测。[0023]结果见图2,其中1道为蛋白上清，2道为包涵体。SDS-PAGE蛋白胶显示，含有SEQIDNO.3表达质粒的大肠杆菌表达量高，满足生物转化反应实验的需要。[0024]实施例4加入0.1M磷酸钾缓冲液pH8.0，50gL含有SEQIDN0.3表达质粒的菌体，55gLL-赖氨酸盐酸盐，0.ImMNAD，敞口反应，25°C，摇床转速设为180rpm。反应中不断取样进行TLC检测，当反应16小时时，检测结果如图3,结果显示16小时生成大量产物，无底物残余。对获得的产物进行定量实验，产物最终浓度为32gL。同时取样进行LC-MS检测，检测结果如图4,图5所示。[0025]当我们在体系中加入L-赖氨酸的时候，其快速转变为L-赖氨酸盐酸盐，然后按照前述实施例的方式进行反应。

权利要求：I.StreptomyceshirsutusATCC19091蛋白作为催化剂的用途，所述的StreptomyceshirsutusATCC19091蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2。2.根据权利要求1所述的用途，其特征是，所述的催化剂用以催化L-赖氨酸盐酸盐或L-赖氨酸生物转化制备L-2-哌啶甲酸的反应。

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