申请/专利权人：常熟理工学院

申请日：2018-09-26

公开（公告）日：2021-07-27

公开（公告）号：CN109161545B

主分类号：C12N15/113(20100101)

分类号：C12N15/113(20100101);C12N15/867(20060101);C12N15/66(20060101);C12N5/10(20060101);A61K31/7105(20060101);A61P1/16(20060101);A61P3/04(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.07.27#授权;2019.02.01#实质审查的生效;2019.01.08#公开

摘要：本发明公开了一种抑制鸡Sirt1基因表达的microRNA，并公开了其重组过表质粒和具体应用，以及利用过表达miRNAs构建稳定低表达Sirt1基因的LMH细胞系。相对于现有技术，本发明以人工设计的miRNA对目的基因进行干扰，并通过简单的PCR技术直接快速的构建该miRNA的过表达载体，本发明所提供的pLNCX‑pmirG为miRNA进行过表达的一个很好的载体，并能依次进行逆转录病毒的包装，结合G418加压筛选和绿色荧光蛋白检测方法可以快速获得稳定过表达miRNA的细胞系，不仅可以为研究揭示Sirt1基因影响肝脏对营养状态的应答机制，也为研究人类、动物肝脏在能量代谢中的功能提供一个独特的肝细胞亚克隆系模型。

主权项：1.一种microRNA过表逆转录病毒载体，其特征在于，其构建方法包括以下步骤：利用pLNHX质粒的基础序列和fpcDNATM6.2-GWEmGFP-miR质粒上的microRNA表达框架序列构建pLNCX-pmiRG质粒，设计引物，采用PCR扩增法分别在pLNCX-pmirG的microRNA表达框添加插入表达gSmiR30前体DNA序列，获得重组过表的microRNA的质粒：pLNCX-gSmiR30；所述pLNCX-gSmiR30设计引物为gga-miR-SIRT1-30-FR，序列如SEQIDNO:5-6所示；其中，所述gSmiR30，其序列如SEQIDNO:1所示，通过克隆鸡Sirt1基因的3′UTR序，然后选取碱基序列中的“CAGCATTAGAAGCTTTGGCAT”位点作为靶点设计得到；PCR反应体系： 反应条件：

全文数据：抑制鸡Sirt1基因表达的microRNA及其重组过表质粒以及LMH细胞系技术领域本发明涉及细胞工程，特别涉及抑制鸡Sirt1基因表达的microRNA及其重组过表质粒以及LMH细胞系。背景技术SIRT1作为依赖NAD+的去乙酰化酶，细胞代谢状态能量状态因子NAD+使SIRT1成为联系能量代谢和基因转录的一个重要分子，SIRT1通过NAD+连接着代谢水平和核内基因转录的网路调控，以及机体对营养、激素和环境刺激作出的应答。肝脏是动物营养物质和能量代谢的重要场所，负责糖原合成、糖异生、脂肪酸与胆固醇的合成以及脂蛋白的生成和分泌等，并能对营养状态和激素信号作出响应，调节机体内的物质与能量平衡，尤其在糖脂类代谢方面发挥着重要的作用。当机体摄入过多的能量物质时，肝脏能将这些过量的能量物质转化为脂肪，并转运到脂肪组织贮存起来。长期摄入过多的能量最终会导致肥胖、脂肪肝和其他肥胖相关的代谢性疾病。在家禽生产中，脂肪沉积过多不仅影响动物的健康，还会引起饲料利用率和产蛋率下降等问题。沉积的脂肪除来自饲料中的少量脂肪外，主要来自肝脏重新合成的脂肪。因此，研究肝脏的脂肪代谢及其调控机制对于控制家禽的脂肪沉积极为重要。本发明利用过表达miRNAs构建稳定低表达Sirt1基因的LMH细胞系，不仅可以为研究揭示Sirt1基因影响肝脏对营养状态的应答机制，也为研究人类、动物肝脏在能量代谢中的功能提供一个独特的肝细胞亚克隆系模型。发明内容发明目的：针对现有技术存在的技术空缺，本申请提供了抑制鸡Sirt1基因表达的microRNA及其重组过表质粒以及LMH细胞系，并提供了相应的构建方法和应用。技术方案：本发明所述的一种抑制鸡Sirt1基因表达的microRNA，命名为gSmiR30，其序列如SEQIDNO:1所示。本发明所述microRNA通过克隆鸡Sirt1基因的3′UTR序，然后选取碱基序列中的以下位点作为靶点：“CAGCATTAGAAGCTTTGGCAT”，设计得到；所述鸡Sirt1基因的3′UTR序如SEQIDNO:2所示。本发明所述的一种抑制鸡Sirt1基因表达的microRNA，命名为gSmiR70，其序列如SEQIDNO:3所示；所述gSmiR70通过克隆鸡Sirt1基因的3′UTR序，然后选取碱基序列中的“TCTGGATTTAGAGCAAGGAAA”位点作为靶点设计得到；所述鸡Sirt1基因的3′UTR序如SEQIDNO:2所示。本发明所述的一种抑制鸡Sirt1基因表达的microRNA，命名为gSmiR91，其序列如SEQIDNO:4所示；所述gSmiR91通过克隆鸡Sirt1基因的3′UTR序，然后选取碱基序列中的“CCATAAGGATGTGGTGTTTAT”位点作为靶点设计得到；所述鸡Sirt1基因的3′UTR序如SEQIDNO:2所示。本发明所述microRNA过表逆转录病毒载体的构建方法，包括以下步骤：利用pLNHX质粒的基础序列和pcDNATM6.2-GWEmGFP-miR质粒上的microRNA表达框架序列构建pLNCX-pmiRG质粒，设计引物，采用PCR扩增法分别在pLNCX-pmirG的microRNA表达框添加插入gSmiR307091前体DNA序列，获得重组过表的microRNA的质粒：pLNCX-gSmiR307091；其中，构建所得pLNCX-pmiRG质粒的序列如SEQIDNO:11所示。其中，所述pLNCX-gSmiR30设计引物gga-miR-SIRT1-30-FR，其序列如SEQIDNO:5-6所示；所述pLNCX-gSmiR70设计引物gga-miR-SIRT1-70-FR，其序列如SEQIDNO:7-8所示；所述pLNCX-gSmiR91设计引物gga-miR-SIRT1-91-FR，其序列如SEQIDNO:9-10所示，详见表1：表1PCR引物序列构建所得microRNA过表逆转录病毒载体pLNCX-gSmiR307091也在本发明的保护范围内。所述microRNA过表逆转录病毒载体pLNCX-gSmiR307091在制备治疗鸡Sirt1基因表达异常相关疾病药物中的应用也在本发明的保护范围内。本发明所述的一种低表达Sirt1基因的LMH细胞系，利用过表达上述microRNA构建所得，包括以下步骤：挑选microRNA进行病毒包装后，感染LMH细胞系；然后利用G418抗性加压筛选和绿色荧光蛋白检测结合的方法筛选获得Sirt1基因低表达的LMH亚克隆细胞系。优选的，所述G418加压筛选的浓度为1μgmL，筛选10天后，转接细胞后继续加压筛选，重复3-5次，最终以获得绿色荧光蛋白表达率在98％以上的细胞为重组细胞，并分别从mRNA和蛋白表达水平确定获得的重组细胞为Sirt1基因低表达的LMH亚克隆细胞系。有益效果：相对于现有技术，本发明所提供以人工设计的miRNA对目的基因进行干扰，并通过简单的PCR技术直接快速的构建该miRNA的过表达载体，本发明所提供的pLNCX-pmirG为miRNA进行过表达的一个很好的载体，并能依次进行逆转录病毒的包装，结合G418加压筛选和绿色荧光蛋白检测方法可以快速获得稳定过表达miRNA的细胞系即靶基因被稳定干扰的细胞系。其最主要优势在于：利用过表达miRNAs构建稳定低表达Sirt1基因的LMH细胞系，不仅可以为研究揭示Sirt1基因影响肝脏对营养状态的应答机制，也为研究人类、动物肝脏在能量代谢中的功能提供一个独特的肝细胞亚克隆系模型。附图说明图1是miRNAs过表达载体的PCR和酶切结果，其中，A：pLNCX-gSmiR307091的PCR结果，B：重组质粒pLNCX-gSmiR307091的EcoRI酶切结果；M为DL5000或DL10000；1、2、3依次为pLNCX-gSmiR307091；4、5、6依次为pLNCX-gSmiR307091质粒；图2是miRNA对靶点作用效果的验证，Control:pLNCX-pmirG；gSmiR30:pLNCX-gSmiR30；gSmiR70:pLNCX-gSmiR30；gSmiR91:pLNCX-gSmiR30；**表示p＜0.01；图3是miRNAs干扰LMH细胞Sirt1基因的结果，Control:pLNCX-pmirG；gSmiR30:pLNCX-gSmiR30；2:gSmiR70:pLNCX-gSmiR30；gSmiR91:pLNCX-gSmiR30,*表示p＜0.05；图4是LMH-gSmiR30细胞系中GFP的表达结果，荧光显微镜观察LMH-gSmiR30中GFP表达情况，A图：明场200×；B图：暗场200×；图5是LMH-gSmiR30细胞系中Sirt1基因的mRNA表达水平，LMH-pmirG:对照；LMH-gSmiR30:SIRT1基因低表达细胞系,**表示p0.01；图6是LMH-gSmiR30细胞系中SIRT1蛋白的表达水平；图7是用WesternIP裂解液提取细胞总蛋白的Westernblot检测结果,以β-Actin作为内参，1:LMH-pmirGControl；2:LMH-gSmiR30为所构建的Sirt1基因低表达细胞系。具体实施方式下面结合具体实施例对本申请作出详细说明。细胞和质粒来源：LMH细胞购自ATCC；pLNHX质粒购自Clontech；pcDNATM6.2-GWEmGFP-miR质粒购自Invitrogen。仪器和设备：实施例1抑制鸡Sirt1基因表达的microRNAs的设计将克隆所获得的鸡Sirt1基因的3′UTR序列输入DesignedmicroRNAtheBLOCK-iTTMRNAiDesigner在线分析工具http:rnaidesigner.thermofisher.comrnaiexpresssetOption.do？designOption＝mirna&pid＝-3453238029932242172，靶位点区选择为“3′UTR”；物种选择chicken，GC含量选择为35％-55％。挑取3个不同位点的、评分最好的3个miRRNAi，分别为：gSmiR30：“5′AUGCCAAAGCUUCUAAUGCUG3′”；gSmiR70：“UUUCCUUGCUCUAAAUCCAGA”和gSmiR91：“AUAAACACCACAUCCUUAUGG”。实施例2miRNAs过表达载体的构建利用pLNHX质粒的基础序列和pcDNATM6.2-GWEmGFP-miR质粒上的microRNA表达框架序列将pcDNATM6.2-GW质粒上的17-1919之间的序列包含CMV启动子、attB1位点、EmGFP基因序列、5′和3′miR侧翼序列、attB2位点和TK多聚腺苷酸信号替换pLNHX质粒上2047-2370区的片段包含HSP70启动子和多克隆位点，成功构建pLNCX-pmiRG质粒，其序列如SEQIDNO:11所示。根据设计的microRNA设计引物，采用PCR扩增法分别在pLNCX-pmirG的microRNA表达框添加插入实施例1设计的microRNA前体DNA序列，获得重组过表的microRNA的质粒：pLNCX-gSmiR30、pLNCX-gSmiR70、pLNCX-gSmiR91。方法如下：以质粒pLNCX-pmiG获得重组过表的microRNA的质粒：pLNCX-pmiG质粒为模板，分别用gga-miR-SIRT1-30-FR、gga-miR-SIRT1-70-FR、gga-miR-SIRT1-91-FR三对引物扩增全长质粒序列，割胶回收DNA目的条带，然后进行5′端磷酸化作用，最后通过片段自连环化，将次连接产物转入DH5α大肠杆菌中，制备获得获得重组过表的microRNA的质粒：pLNCX-gSmiR30、pLNCX-gSmiR70、pLNCX-gSmiR91。步骤：⑴PCR反应反应体系：反应条件：⑵0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，并割胶回收目的片段；⑶回收片段5′端磷酸化处理：体系：反应条件：37℃30min，70℃10min。⑷直接取⑶的产物，进行自我连接反应：5将连接产物转化入感受态细胞DH5α中，Amp抗性筛选，挑取抗性阳性菌落扩增培养后，抽提质粒，用EcoRI酶切鉴定，阳性质粒送测序鉴定。测序正确的即为所构建的过表达microRNA的质粒：pLNCX-gSmiR30、pLNCX-gSmiR70、pLNCX-gSmiR91。构建所得miRNAs过表达载体的PCR结果和酶切结果如图1所示，其中，A：pLNCX-gSmiR307091的PCR结果，B：重组质粒pLNCX-gSmiR307091的EcoRI酶切结果M为DL5000或DL10000；1、2、3依次为pLNCX-gSmiR307091；4、5、6依次为pLNCX-gSmiR307091质粒。由图1-A可见，以pLNCX质粒为模板，分别用引物gga-miR-SIRT1-30-FR、gga-miR-SIRT1-70-FR、gga-miR-SIRT1-91-FR进行PCR扩增得到大于5000bp约7000bp的片段，这与设计扩增的片段的理论值相一致，说明目的片段扩增成功，这3条片段经自我环化后转化入DH5α中，挑取Amp抗性阳性的菌落培养，并提取质粒。由图1-B可见，所提质粒经EcoRI酶切后分别得到7000bp左右DNA片段，与设计的理论值相一致，说明连接和转化成功，然后分别将酶切阳性的克隆送测序。实施例3miRNAs效果试验1、根据本试验室所克隆的鸡Sirt1基因3′UTR序列，以ggaSIRT1-UTR672-FATCTCGAGAGTGCTCACTGGTTACAGGggaSIRT1-UTR672-RATGCGGCCGCAAGCTCAGTAACTGAAGC，通过PCR技术从鸡的基因组上扩增获得包含有3个miRNAsgSmiR30、70和91作用靶位点的Sirt1基因3′UTR序列，并将其克隆入pSicheck2中SyntheticRenillaluciferasegenehRluc基因3′UTR区，获得双荧光素酶报告载体pSicheck2-gSirt1-UTR672。步骤如下：⑴酚仿法提取鸡红细胞的基因组；⑵PCR扩增目的片段gSirt1-UTR672：反应体系：反应条件：⑶1％琼脂糖凝胶电泳后回收目的片段，用XhoI和NotI分别消化回收片段和报告载体pSicheck2质粒；⑷琼脂糖电泳后割胶回收目的片段，然后将两者连接，转化入DH5α，并PCR和酶切鉴定，提取阳性质粒送测序，获得构建正确的重组报告载体pSicheck2-gSirt1-UTR672。构建报告载体psiCHECH2-gSirt1-UTR672的PCR和酶切鉴定结果如图2，M:DL5000或DL10000；1:gSirt1-UTR672片段的扩增结果；2:重组报告质粒psiCHECH2-gSirt1-UTR672的NotI和XhoI双酶切结果。由图2-A可见，以鸡基因组DNA模板，用引物ggaSIRT1-UTR672-FR，成功扩增获得长约700bp的片段，与预计扩增大小一致。图2-B结果说明，目的片段成功插入至RenillaluciferasegenehRluc基因的3′UTR，取阳性质粒测序，获得构建正确的报告载体psiCHECH2-gSirt1-UTR672。2、miRNAs作用靶点的效果鉴定：CHO-K1细胞系中分别共转染3个miRNAs的过表达载体pLNCX-gSmiR307091和含有Sirt1基因3′UTR区靶位点序列的报告载体pSicheck2-gSirt1-UTR672，48h后检测荧光素酶的活性来验证作用3个miRNAs效果。步骤如下：⑴用F12K含10％胎牛血清，1％双抗复苏培养CHO-K1，待其生长至汇合度在90％传代细胞，按1.2×105mL的细胞量铺于24孔培养板0.5mL孔，37℃5％CO2培养22h，更换不含抗生素的F12K完全培养基，继续培养2h；⑵共转染，配制转染混合液OptiMEM32μL病毒表达质粒pLNCX-gSmiR30350ng和报告载体质粒pSicheck2-gSirt1-UTR67250ng；X-tremeGENE9DNATransfectionReagent1.2μL，混匀后室温作用20min，，混匀，21℃静置20min后，将混合液滴加入细胞培养基中，混匀后继续培养48h；⑶荧光素酶检测Dual-LuciferaseReporterAssaySystemKit，方法如下：①取24孔培养板，弃培养基，加入1mL37℃预热的PBS洗涤一次；②检测过程参照Dual-LuciferaseReporterAssaySystemKit说明书进行；③计算海肾荧光素酶活性和萤火虫荧光素酶活性比值即相对荧光素酶活性。⑷在LMH细胞中，用X-tremeGENE9DNATransfectionReagent瞬时转染验证有效的3个miRNAs过表达载体pLNCX-gSmiR307091，48h后荧光定量检测Sirt1基因的mRNA水平。由图3可见，3个miRNAs均能有效抑制海肾荧光素酶的活性抑制效率达到97％以上，说明所设计的3个miRNAs可能可以通过对应的靶位点参与鸡Sirt1基因的转录后表达调控。由图4可见，瞬时过表达这3个miRNAs，LMH细胞中的Sirt1基因的mRNA水平被抑制了30％左右，进一步说明这三个3个miRNAs能从mRNA水平干扰Sirt1基因的表达。实施例4构建重组细胞为Sirt1基因低表达的LMH亚克隆细胞系挑选gSmiR30进行病毒包装后，感染LMH细胞系，构建Sirt1基因低表达的LMH亚克隆细胞系。方法如下：⑴用DMEM完全培养基含10％胎牛血清，1％双抗培养GP2-293细胞系，待其长至90％以上汇合度时进行细胞传代，按5×105mL的细胞浓度接种于10cm的培养皿培养基为10mL，37℃5％CO2培养22h后，换成无抗生素的DMEM完全培养基，继续培养2h；⑵配制转染混合液OptiMEM500μL含病毒表达质粒pLNCX-gSmiR30和包装辅助质粒pVSV-G各2.5μg；X-tremeGENE9DNATransfectionReagent15μL，混匀后室温作用20min，然后均匀滴加入培养皿，37℃5％CO2培养72h；⑶4℃500×g离心10min，收集上清，分装后冻存-80℃，即得病毒颗粒。⑷LMH细胞按3×105孔接种于12孔培养板中，1mL孔的Waymouth′s完全培养基，37℃5％CO2培养22h后换不含抗生素的Waymouth′s完全培养基，继续培养2h；5用Waymouth′s基础培养将收集的病毒包装上清倍比稀释后和聚凝胺混合，向细胞培养基中滴加0.5mL感染液培养基的12体积，聚凝胺最终的浓度≤4μgmL，混匀；⑹将培养板置于32℃，1,200×g离心90min以提高感染效率，然后37℃5％CO2培养18h，更换新鲜的Waymouth′s完全培养基，去除聚凝胺；⑺继续培养24h后，添加G418至终浓度1μgmL，每天3d换液，进行G418的抗性持续筛和亚克隆化培养G418加压筛选的浓度为1μgmL，筛选10天后，转接细胞后继续加压筛选，重复3-5次，筛选重组细胞；⑻获得重组细胞LMH-pLNCX-pmirGLMH-pmirG和LMH-pLNCX-gSmiR30LMH-gSmiR30细胞表达绿色荧光蛋白的比例在98％以上之后，用含100ngmL的G418的Waymouth′s完全培养基进行传代培养。⑼收集重组细胞，提取总RNA和总蛋白，用荧光定量和WesternBlot分别进行Sirt1基因mRNA和蛋白表达水平的检测。利用G418抗性加压筛选和绿色荧光蛋白检测结合的方法筛选获得Sirt1基因低表达的LMH亚克隆细胞系，从图5结果可以看出，经多次G418重复的筛选，最终获得的细胞的荧光蛋白的表达率达到了98％以上，说明所获得的细胞都已成功转入了荧光标记蛋白。从图6和图7的结果可以看出，所筛选到的重组细胞中Sirt1在mRNA和蛋白表达水平都得到了有效的抑制，说明Sirt1基因稳定低表的重组细胞LMH-gSmiR30的LMH亚克隆细胞系构建成功。序列表110常熟理工学院120抑制鸡Sirt1基因表达的microRNA及其重组过表质粒以及LMH细胞系16011170SIPOSequenceListing1.0210121121212RNA213人工序列ArtificialSequence4001augccaaagcuucuaaugcug2121022111710212DNA213人工序列ArtificialSequence4002agtgctcactggttacaggaattttccaccagcattagaagctttggcatgtcaggaaga60atgtttacgtctggatttagagcaaggaaaccataaggatgtggtgtttataagcaactg120aaacagattttcatgcttagttttttacctttttcaataaaattctcttactgcacactc180aacactaacttttttttttaaggtactaggaatatctaagcaattattactatgttcact240tttaagtcatctgtctgatcaggcatccatgtatataatacctattttgcataataaatt300tcagcttatattatttttaaacagttttgaaaaagccattggaatgttaaactaatataa360agggaacagctaatttaaaccaaaaaagggtattatcacacttcttgctttgtaacagtt420tggtttatttaaaacttcttacgcttctgctaaacctttagttctcgcatagcctatcat480taaacactggcattttctaagacctactgtggcagctaattttttgctttaacaattagt540ttgtatgtttgagacatacttaaatgtgagtagatagttaaaaatggaaacaagacagta600agcacttgaaaactcctaatcttttttagactgataagaagtgctgtgaaaatgcttcag660ttactgagcttaatacttcctgtggacatgaagcaatgttgacattggctccttagcaat720tataatactggaacgtcagtattttaggcaaaatggattcccaatggcagaagtttttca780cattgtatacaagaagtcaaatatagtgcagcttgcattaacaatagtattcgatcaatt840gccaaggctgtaacatggaggcttggctgagtacacaacagcgttcctaccagcatgtga900gaaggcacggaaaccaaatctcttcctgtaatgcttacggaagtaacagaatcagaagaa960acttgctcagagagcaacagcctctgctgctactgctgtgtgggtgaaatacagattcat1020cacctgctgcttcgagtgatgtcccagacggggaacgtgactttccacccgctagctcca1080acgtgcatcttagaagcaaagcagctactccaattatcacattgcgtattaaagtgctaa1140gctgccttaaaactggatgttgcaaactttcaagtgcagattgtttccaagcctttagaa1200ttattttgtaaaattgtacagtgcagtagtaagtgaatcagcattttttatataaaccac1260tttttcaacattggcccaaatgaactctacggtgtagattattcatatcctttgctttaa1320tatttattacattttggagatgtatagtagctgttctttgaaggtaagatacatcactta1380atgaatatttaagaacagttttctgtattcatctaaaaatgttggcatgttgtctcattg1440tccaaatttaatacagctcttatttggctacactaaagaatgcaatatgtttagttttca1500cttgcatgttacaatgtattagtttgtgctataggagatattttaaattgaaatactttg1560ttttaaaatatttttacagtgaggattgttttctgctcttttatattgtatatagtgtct1620tttatgtaatctactggcatatgttttgtagaagactgtttaaaatgaccggctatcttc1680ctgcaacttttgaaatacaaaaaaaaaaaa1710210321121212RNA213人工序列ArtificialSequence4003uuuccuugcucuaaauccaga21210421121212RNA213人工序列ArtificialSequence4004auaaacaccacauccuuaugg21210521156212DNA213人工序列ArtificialSequence4005cactgactgaccagcattaagctttggcatcaggacacaaggcctgttactagcac56210621156212DNA213人工序列ArtificialSequence4006gccaaaaccagcattagaagctttggcatcagcatacagccttcagcaagcctcca56210721156212DNA213人工序列ArtificialSequence4007cactgactgactctggattgagcaaggaaacaggacacaaggcctgttactagcac5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权利要求：1.一种抑制鸡Sirt1基因表达的microRNA，命名为gSmiR30，其序列如SEQIDNO:1所示。2.根据权利要求1所述的抑制鸡Sirt1基因表达的microRNA，其特征在于，所述gSmiR30通过克隆鸡Sirt1基因的3′UTR序，然后选取碱基序列中的“CAGCATTAGAAGCTTTGGCAT”位点作为靶点设计得到。3.一种抑制鸡Sirt1基因表达的microRNA，命名为gSmiR70，其序列如SEQIDNO:3所示；所述gSmiR70通过克隆鸡Sirt1基因的3′UTR序，然后选取碱基序列中的“TCTGGATTTAGAGCAAGGAAA”位点作为靶点设计得到。4.一种抑制鸡Sirt1基因表达的microRNA，命名为gSmiR91，其序列如SEQIDNO:4所示；所述gSmiR91通过克隆鸡Sirt1基因的3′UTR序，然后选取碱基序列中的“CCATAAGGATGTGGTGTTTAT”位点作为靶点设计得到。5.一种权利要求1-4中任一所述microRNA过表逆转录病毒载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：利用pLNHX质粒的基础序列和fpcDNATM6.2-GWEmGFP-miR质粒上的microRNA表达框架序列构建pLNCX-pmiRG质粒，设计引物，采用PCR扩增法分别在pLNCX-pmirG的microRNA表达框添加插入表达gSmiR307091前体DNA序列，获得重组过表的microRNA的质粒：pLNCX-gSmiR307091。6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述pLNCX-gSmiR30设计引物为gga-miR-SIRT1-30-FR，序列如SEQIDNO:5-6所示；所述pLNCX-gSmiR70设计引物gga-miR-SIRT1-70-FR，序列如SEQIDNO:7-8所示；所述pLNCX-gSmiR91设计引物gga-miR-SIRT1-91-FR，序列如SEQIDNO:9-10所示。7.权利要求5或6构建所得microRNA过表逆转录病毒载体。8.权利要求7所述microRNA过表逆转录病毒载体在制备治疗鸡Sirt1基因表达异常相关疾病药物中的应用。9.一种低表达Sirt1基因的LMH细胞系，其特征在于，利用过表达权利要求1-4中任一所述microRNA构建，包括以下步骤：挑选权利要求1所述的microRNA进行病毒包装后，感染LMH细胞系；然后利用G418抗性加压筛选和绿色荧光蛋白检测结合的方法筛选获得Sirt1基因低表达的LMH亚克隆细胞系。10.根据权利要求9所述的低表达Sirt1基因的LMH细胞系，其特征在于，所述G418加压筛选的浓度为1μgmL，筛选10天后，转接细胞后继续加压筛选，重复3-5次，最终以获得绿色荧光蛋白表达率在98％以上的细胞为重组细胞。

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