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申请/专利权人：上海锐赛生物技术有限公司

摘要：本发明涉及Crtc2Creb复合物阻断多肽及其衍生药物多肽和应用，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，可以用于制备治疗肥胖、脂肪肝、高脂血症和2型糖尿病药物。所述的药物多肽包括靶向抑制Crtc2Creb复合物形成的阻断功能结构域和穿膜功能结构域，所述靶向抑制Crtc2Creb复合物形成的阻断功能结构域氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。上述药物多肽具备显著的调节血糖、血脂以及抑制肝脏脂质沉积的作用，可以单独作为治疗肥胖、脂肪肝和2型糖尿病等代谢疾病的治疗药物或辅助其他治疗方式进行治疗。

主权项：1.一种具有靶向抑制Crtc2Creb复合物形成能力的多肽，其特征在于，氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。

全文数据：Crtc2Creb复合物阻断多肽及其衍生药物多肽和应用技术领域本发明涉及脂质代谢异常相关的疾病治疗领域，更特别地，涉及Crtc2Creb复合物阻断多肽及其衍生药物多肽和应用。背景技术随着国民经济的快速发展，中国人的生活水平有了巨大改善。同时快节奏的生活方式也极大的影响着国人的饮食结构。高糖高脂的快餐饮食方式和运动频次的下降带来的是代谢类疾病发病率的增高，主要包括肥胖、脂肪性肝病、高脂血症以及糖尿病等。这类疾病不但严重影响患者的生活质量和寿命，也给患者家庭和社会带来极大的经济负担。有效的预防和治疗代谢类疾病是我们亟待解决的一个难题。肝脏在能量代谢过程中发挥重要作用，肝脏糖代谢和脂代谢功能的紊乱与包括肥胖、脂肪性肝病、高脂血症以及糖尿病等代谢类疾病的发生息息相关。CRTC2是维持肝脏糖脂代谢稳态的一个重要调节因子。研究证实，CRTC2主要在肝脏中表达。正常状态下，CRTC2处于磷酸化状态并通过结合14-3-3蛋白定位与细胞质。当细胞内钙离子和cAMP信号升高时，CRTC2被钙调磷酸酶去磷酸化，进入细胞核，作为转录调控因子与CREB结合从而参与糖异生和内质网应激相关的基因的转录，糖异生的增加是II型糖尿病等高血糖表型疾病的典型表现。另外，CRTC2CREB转录活性的升高也是脂代谢异常的重要调节因素。研究表明，CRTC2CREB通过下调sirt1、Ppar表达，抑制脂肪酸的β氧化作用，参与肝脏甘油三酯的生成。综上所述，CRTC2CREB转录活性的异常是肥胖、脂肪性肝病、高脂血症以及糖尿病等代谢类疾病的重要因素。研究证实，CRTC2蛋白入核后通过N端Coiled-Coil结构域与CREB蛋白b-ZIP结构结合形成CRTC2CREB复合体而具备转录调节活性。因此，阻断CRTC2CREB的结合，抑制糖异生和脂质生成相关基因的表达，是调节肝脏糖脂代谢异常，治疗代谢类疾病的重要手段。发明内容本发明设计了一种靶向抑制CRTC2CREB相互作用的十三肽小分子（以下称CCB-17），利用穿膜肽和十三肽小分子进行共价键链接，获得一种二十四肽药物分子（以下称pCCB-17），具备高效的透膜效率和调节肝脏糖脂代谢的活性。本发明发明了一种具有靶向抑制Crtc2Creb复合物形成能力的多肽，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。上述具有靶向抑制Crtc2Creb复合物形成能力的多肽可以用于制备治疗肥胖、脂肪肝、高脂血症和2型糖尿病药物。本发明还涉及一种药物多肽，包括靶向抑制Crtc2Creb复合物形成的阻断功能结构域和穿膜功能结构域，所述靶向抑制Crtc2Creb复合物形成的阻断功能结构域氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。所述穿膜功能结构域的优选氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。药物多肽的优选氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。进一步的，所述穿膜功能结构域位于所述药物多肽的N端，所述靶向抑制Crtc2Creb复合物形成的阻断功能结构域位于所述药物多肽的C端。本发明还涉及以上述药物多肽在制备治疗肥胖、脂肪肝和2型糖尿病药物中的应用。本发明的优点在于，本发明的靶向抑制CRTC2CREB复合物形成的多肽CCB-17和药物多肽pCCB-17在体外均能有效抑制CRTC2CREB复合物的形成；药物多肽pCCB-17在饮食诱导肥胖和脂肪肝小鼠模型中具备显著的调节血糖、血脂以及抑制肝脏脂质沉积的作用。本发明的药物多肽可以单独作为治疗肥胖、脂肪肝和2型糖尿病等代谢疾病的治疗药物或辅助其他治疗方式进行治疗。附图说明图1为多肽的穿膜效率和胞内定位检测的荧光显微镜照片。图2为多肽干预前后CRTC2和CREB免疫共沉淀检测结果。图3为高糖高脂饮食条件下，多肽干预组和对照组小鼠的体重曲线以及皮下脂肪重量对比。图4为高糖高脂饮食条件下，多肽干预组和对照组小鼠的随机血糖和口服糖耐量对比。图5为高糖高脂饮食条件下，多肽干预组和对照组小鼠血清和肝脏中甘油三脂含量对比。图6为高糖高脂饮食条件下，多肽干预组和对照组小鼠肝脏HE染色和油红染色图片。图7为高糖高脂饮食条件下，多肽干预组和对照组小鼠肝脏中sirt1、Ppar的表达检测对比。具体实施方式以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。实施例一：多肽分子设计和合成通过生物信息学分析已有CRTC2和CREB蛋白结构信息，利用计算机分子对接软件分析CRTC2-CREB的结合结构域和关键氨基酸残基，然后利用多肽-蛋白分子对接软件分析，设计能够高亲和结合RBBp4蛋白并阻断SALL4-RBBp4相互作用的多肽分子，经筛选获得特异性靶向抑制Crtc2Creb复合物形成的多肽，氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，以下称CCB-17。筛选一种穿膜肽，氨基酸序列如SEQIDNO:2所示，用于引导上述CCB-17高效的进入胞浆和细胞核。设计一种药物多肽，以下称pCCB-17，包括穿膜肽序列和CCB-17肽序列，其中穿膜肽位于N端，CCB-17肽位于C端，穿膜肽与CCB-17肽通过共价键链接，药物多肽pCCB-17氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。上述穿膜肽和pCCB-17肽委托金斯瑞生物科技有限公司采用固相合成的方法进行多肽合成，纯度≥95%，C端进行异硫氰酸荧光素（FITC）标记。其中穿膜肽作为阴性对照。实施例二：多肽穿膜及细胞定位检测1.复苏培养LO2细胞。2.将细胞按合适的细胞数接种至96孔板，每株细胞接种3复孔。3.细胞接种6小时后，加入受试多肽，终浓度30uM。4.在多肽处理24h后记录细胞FITC荧光，评判多肽透膜效率和胞内定位。检测结果显示药物多肽pCCB-17能够高效穿透细胞膜，胞内定位在胞浆和胞核，检测结果如图1所示。实施例三：免疫共沉淀检测药物多肽pCCB-17对Crtc2Creb复合物的阻断1.复苏培养LO2细胞。2.利用终浓度30uM的穿膜肽和药物多肽pCCB-17处理LO2细胞24h，去培养基，PBS清洗两次，1000rpm离心5分钟，收集细胞。3.利用RIPA缓冲液悬浮细胞，冰上孵育30min，利用超声破碎仪裂解细胞（30son，30soff，5cycle）。4.裂解液13000rpm离心10min，收集上清并进行蛋白定量。5.取总蛋白1mg的裂解液与3ugCRTC2抗体（abcam#ab1090814°C孵育，摇床过夜。6.加入50ulProteinADynabeads®孵育1h，利用IPbuffer清洗磁珠6次。7.利用2XSDS缓冲液洗脱，100℃孵育变性磁珠偶联的蛋白。8.Westernblot检测Crtc2和Creb，其中CRTC2抗体为abcam#ab109081，Creb抗体为abcam#ab32515。检测结果显示药物多肽pCCB-17在细胞内能够阻断Crtc2与Creb的结合，抑制Crtc2Creb复合物的形成。检测结果如图2所示。实施例四：药物多肽体内调节糖脂代谢的活性检测1.4周龄雄性C57小鼠30只，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司。2.利用高脂饲料（60%fatdiet，D12492，ResearchDiets）饲养C57小鼠至16周龄。3.高脂饲养至16周龄后，随机分为3组。模型组10只，继续高脂饲养；对照组10只，继续高脂饲养，同时利用穿膜肽按照15.6mgkg的剂量进行尾静脉给药，2天一次，共计给药14次；pCCB-17干预组10只，继续高脂饲养，同时利用穿膜肽按照15.6mgkg的剂量进行尾静脉给药，2天一次，共计给药14次。4.给药开始后，每周测量体重一次。5.药物干预第28天，分别测量各组小鼠的禁食血糖、随机血糖、血液TG含量。6.药物干预第28天，分别进行各组小鼠的口服葡萄糖糖耐检测。7.药物干预第28天，处死小鼠，剥离小鼠腹股沟、性腺以及内脏脂肪，称取各组小鼠脂肪湿重。取肝脏组织，测量肝脏TG含量。8.对各组小鼠肝脏组织进行匀浆，提取总蛋白，蛋白定量后利用Westernblot检测各组小鼠肝脏中sirt1、Ppar的表达，其中sirt1抗体为abcam#ab104833，Pparα抗体为abcam#ab126285。检测结果显示相较于穿膜肽对照，pCCB-17药物多肽显示出显著的降低血糖血脂、调节体重体脂以及改善肝脏脂质沉积的作用，如图3-6所示；同时，pCCB-17药物多肽显著增加肝脏组织中脂肪酸β氧化的关键因子Sirt1和Pparα的表达，如图7所示。以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域技术人员对本发明的技术方案所作的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围之内。上海锐赛生物技术有限公司Crtc2Creb复合物阻断多肽及其衍生药物多肽和应用AJ1818793113PRT人工序列1ArgLysPheSerGluLysIleAlaLeuHisLysGlnArg1510211PRT人工序列2TyrGlyArgLysLysArgArgGlnArgArgArg1510324PRT人工序列3TyrGlyArgLysLysArgArgGlnArgArgArgArgLysPheSer151015GluLysIleAlaLeuHisLysGlnArg1620

权利要求：1.一种具有靶向抑制Crtc2Creb复合物形成能力的多肽，其特征在于，氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。2.权利要求1所述的具有靶向抑制Crtc2Creb复合物形成能力的多肽在制备治疗肥胖、脂肪肝、高脂血症和2型糖尿病药物中的应用。3.一种药物多肽，其特征在于，包括靶向抑制Crtc2Creb复合物形成的阻断功能结构域和穿膜功能结构域，所述靶向抑制Crtc2Creb复合物形成的阻断功能结构域氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。4.根据权利要求3所述的药物多肽，其特征在于，所述穿膜功能结构域氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。5.根据权利要求3所述的药物多肽，其特征在于，氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。6.根据权利要求3所述的药物多肽，其特征在于，所述穿膜功能结构域位于所述药物多肽的N端，所述靶向抑制Crtc2Creb复合物形成的阻断功能结构域位于所述药物多肽的C端。7.权利要求3-6中任一项所述的药物多肽在制备治疗肥胖、脂肪肝和2型糖尿病药物中的应用。

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