申请/专利权人：南华大学

申请日：2021-03-29

公开（公告）日：2022-12-13

公开（公告）号：CN113075323B

主分类号：G01N30/02

分类号：G01N30/02;G01N30/06;G01N30/72;G01N30/88

优先权：["20210124 CN 2021100924175"]

专利状态码：失效-未缴年费专利权终止

法律状态：2024.04.05#未缴年费专利权终止;2022.12.13#授权;2021.07.23#实质审查的生效;2021.07.06#公开

摘要：BeSO4染毒16HBE细胞差异表达蛋白检测与分析方法，涉及呼吸系统疾病实验研究领域，步骤如下：1、细胞培养；2、样品制备；3、蛋白还原处理；4、蛋白烷基化处理；5、蛋白酶解；6、对蛋白进行TMT标记；7、对样品进行LC‑MSMS检测；8、GO和KEGG富集分析；9、PPI网络图分析。本发明利用TMT标记的定量蛋白质组学技术和生物信息学分析，筛选BeSO4处理16HBE细胞前后的差异表达蛋白，分析了差异表达蛋白参与的生物学过程及重要信号途径，并进一步筛选了对后续研究具有重要参考价值的关键蛋白，为后续探究BeSO4致16HBE细胞毒性机制及寻找潜在生物标志物提供了新方向。

主权项：1.BeSO4染毒16HBE细胞差异表达蛋白检测与分析方法，其特征是，步骤如下：S01、细胞培养：取16HBE细胞，分为实验组和对照组分别进行传代培养；实验组的培养基中额外添加BeSO4，并调节培养基中的BeSO4浓度为150ugml；对照组的培养基不添加BeSO4；48小时后分别收集实验组和对照组的细胞；S02、样品制备：a、将实验组和对照组的细胞分别置于离心管中，在每个离心管中分别加入200ul8Murea裂解液和3ul蛋白酶抑制剂，待裂解液与细胞充分接触后，超声震荡使细胞裂解，离心处理并分别收集每个离心管中的上清液，上清液中含有细胞内的蛋白质；b、分别测定实验组和对照组的上清液中的蛋白质浓度，然后分别提取实验组和对照组的上清液，置入不同的超滤管内管中，确保每份提取出的样品中的蛋白质含量均为150ug；S03、蛋白还原处理：a、在各超滤管内管中分别加入10mM的DTT溶液，将各超滤管中的溶液量补足至500ul；再分别将各超滤管进行离心处理，离心处理后，丢弃超滤管外管中的溶液；b、重复a分步骤至少两次，使裂解液被DTT充分置换掉；c、将各超滤管置于37℃的孵育箱中1h，使超滤管内管中的蛋白质与DTT充分发生还原反应；S04、蛋白烷基化处理：a、在各超滤管内管中分别加入20mM的IAA溶液，将各超滤管中的溶液量补足至500ul；再分别将各超滤管进行离心处理，离心处理后，丢弃超滤管外管中的溶液；b、重复a步骤至少两次，使DTT被IAA充分置换掉；c、将各超滤管静置于37℃的孵育箱中避光静置1h，使超滤管内管中的蛋白质与IAA充分发生烷基化反应；S05、蛋白酶解：a、在各超滤管内管中分别加入100mM的TEAB溶液，将各超滤管中的溶液量补足至500ul；再分别将各超滤管进行离心处理，离心处理后，丢弃超滤管外管中的溶液；b、重复a步骤至少两次，使IAA被TEAB充分置换掉；c、将各超滤管内管中的溶液分别转移至不同的离心管中，再分别对各离心管进行离心处理，使离心管中的溶液都汇集到离心管的底部；d、在各离心管中分别加入胰蛋白酶，再将各离心管均置于37℃的孵育箱中进行酶解反应14-16h；S06、对蛋白进行TMT标记：a、使用TMT标签对酶解后的各离心管内的样品进行标记，每个样品使用1个标签；b、标记完成后，各离心管内分别加入8ul的5%羟胺，再将各离心管置于37℃的孵育箱中15min，以终止标记反应；S07、对样品进行LC-MSMS检测：a、将所有的离心管内的溶液混合为一管样品，再对混合后的样品进行浓缩干燥，然后加入100ul的0.1%FA溶解干燥浓缩后的样品，之后对溶解后的样品进行分馏，获得45管分馏样品，将所有的分馏样品浓缩蒸干以待后续实验使用；b、将45管浓缩蒸干样品分别命名为1号、2号、3号······45号，在1-15号浓缩蒸干样品中分别加入20ul的0.1%FA进行溶解，然后用1号溶液依次溶解16号和31号样品，用2号溶液依次溶解17号和32号样品，用3号溶液依次溶解18号和33号样品，以此类推，用15号溶液依次溶解30号和45号样品，最终得到15管溶液，每管溶液中均包含3管浓缩蒸干样品的物质量；c、将15管溶液于质谱仪进行上机检测，针对检测数据使用UniProt数据库进行搜索，获得包含蛋白种类、丰度信息和相对分子量的原始数据；S08、GO和KEGG富集分析：a、按照Pvalue＜0.05的标准，并通过Persue软件对原始数据进行筛选，找到差异表达蛋白；b、基于R语言“clusterProfiler”及“org.Hs.eg.db”两个软件包对差异表达蛋白进行GO富集分析和KEGG富集分析，通过GO富集分析获取差异表达蛋白的生物学功能、分布位置和分子功能，通过KEGG富集分析获取差异表达蛋白参与BeSO4致16HBE细胞损伤的信号途径；S09、PPI网络图分析：a、将差异表达蛋白输入STRING在线数据库，将检索结果保存为TSV格式文件；b、通过Cytoscape软件对TSV格式文件进行可视化分析，绘制出上调差异蛋白组成的PPI网络图和下调差异蛋白组成的PPI网络图；c、通过Cytoscape软件的MCODE插件，分别对上调差异蛋白组成的PPI网络图和下调差异蛋白组成的PPI网络图中的节点信息进行计算，进一步提取出这两种PPI网络图中的关键蛋白模块，称为上调关键蛋白模块和下调关键蛋白模块；d、对上调关键蛋白模块和下调关键蛋白模块分别作GO富集分析，以获取上调关键蛋白模块和下调关键蛋白模块的生物学功能、分布位置和分子功能；e、根据上调关键蛋白模块和下调关键蛋白模块的生物学功能筛选出与BeSO4致16HBE细胞损伤相关的关键蛋白；上调关键蛋白分别为：RIOK2、CSNK1D和HEATR1；下调关键蛋白分别为：PRDX5、P4HB、GLRX3、PDIA3、PRDX2、TXN、SOD2、CTNNB1和HMGB1。

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